林业生物技术 知识课件3.原生质体技术 知识.ppt

3、原生质体的培养 3.3 愈伤组织形成和植株再生 细胞壁再生 细胞分裂与生长 愈伤组织形成 植株再生 3、原生质体的培养 细胞壁的再生 有活力的原生质体在适宜的培养基上很快就能再生细胞壁，快的仅需10分钟，多数植物在培养后10小时或更长时间。 出芽的现象：细胞壁形成不均匀。 只有能形成完好细胞壁的再生细胞才能进入细胞分裂的阶段。 细胞分裂和生长  一般原生质体培养2～7 d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。 3、原生质体的培养 愈伤组织形成 大多数情况下原生质体培养二周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1 mm的小愈伤组织。 原生质体培养7～10天后必需及时添加新鲜的低渗培养基：1、提供营养，保持分裂；2、平衡渗透压。 植株再生 1、将原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可一步成苗（器官和胚胎发生两条途径）。 2、两步成苗法（更适合）：首先将愈伤组织培养于含低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培养基上分化成苗。 3、原生质体的培养 原生质体培养过程 原生质体 固体培养基上 小愈伤组织 细胞团 再生植株 再分化 3、原生质体的培养 ⑴ 基因型 通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定的(Koornneef M et al.,1987)。Cheng和Veilleux(1991)对芙薯(S. Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是受2个独立位点的显性基因所控制(Cheng et al., 1991)。 ⑵培养成份—Ca2+ , NH4+ ⑶渗透稳定剂 ⑷培养密度：105个/ml。低密度条件下，细胞代谢产物扩增到培养基中影响细胞内浓度。 3.4 影响原生质体培养的因素 4、原生质体的融合 植物体细胞杂交的程序 4、原生质体的融合 4.1 融合方法 PEG（聚乙二醇）融合、电融合 PEG融合： PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG(聚乙二醇)分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连，进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 PEG 诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 缺点：融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 4、原生质体的融合 融合液：CaCl2 2H2O 8～10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5～1.0mol pH 5.6 诱导液：融合液＋PEG 20～45％ 稀释液： A液（g/100ml）pH6.0 B液（g/100ml）pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169 4、原生质体的融合 P1 P2 P1 P2 混合静止1min. 融 合 融合液 加入PEG 稀 释 洗 涤 加入稀释液 加入培养基 培 养 选 择 4、原生质体的融合 PEG法原生质体融合过程： 融合过程： 图：A B C D E F 原生质体位置： BI CI DI EI FI B Ⅱ CⅡ DⅡ E Ⅱ F Ⅱ B Ⅲ CⅢ D Ⅲ EⅢ FⅢ 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 * 1 2 原生质体的研究概况 原生质体的分离 3 原生质体的培养 4 5 原生质体的融合 杂种细胞的选择及体细胞杂种植物的鉴定 原生质体技术的具体方法步骤？ 什么是原生质体？如何获得？ 思考与讨论 1.原生质体的研究概况 1.1 原生质体的概念 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。? 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。? 核质体(nuclea