林业生物技术 知识课件7.基因工程常用载体.pptVIP

2、 λ噬菌体载体 2.2 λ噬菌体的分子生物学 A、基因组结构 48502bp GenBank j02459 或M17233 2、 λ噬菌体载体 粘性末端：?噬菌体的基因组是由双链DNA组成，其线性分子的两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此互补的5?单链突出序列，即通常所说的粘性末端。 cos位点：注入感染寄主细胞内的?DNA线性分子，会迅速环化形成双链DNA分子。这种由粘性结合形成的特定的双链区段称为cos位点（cos=cohesive-end site，即粘性末端位点） 2、 λ噬菌体载体 为叙述的方便，?噬菌体基因组被人为地区分为三个区域： 左侧区——自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白和尾部蛋白合成所需的全部基因； 中间区——介于基因J与基因N之间，又称为非必要区。该区的编码基因与噬菌斑形成无关，但包括重组相关基因(redA和redB)；整合基因(int)，及删除基因(xis)； 右侧区——位于N基因的右侧，包括全部的调控基因，如复制基因(O)和溶菌基因(S及R)。 2、 λ噬菌体载体 2、 λ噬菌体载体 B.λ的可取代区 溶源化λ的正确切离 正常λ 不正常切离 不正常λgal替换或bio替换 J基因与Cro基因之间的丢失不影响裂解生长 可插入9～23kb 2、 λ噬菌体载体 2.3 λ噬菌体的选择标记 lacZ 基因 lacZ 基因也可用于 λ 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的 β-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。 基因 cⅠ 失活 基因 cⅠ 是 λ 噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达，与操纵区 o R 和 o L 结合。 cⅠ 基因的表达促进 λ 噬菌体进入溶源状态，基因 cⅠ 产物活性受到影响会促进 λ 噬菌体进入裂解循环。 2、 λ噬菌体载体 Spi 筛选 野生型 λ 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。 如果 λ 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，同时带有 chi 位点，并且宿主菌为 rec + ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作 Spi- 。 通过λ噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。 2、 λ噬菌体载体 2.4 代表性λ噬菌体 有插入型载体和置换型载体。通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体（insertion vectors），而允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。 λ 噬菌体载体主要用于构建基因文库，特别是cDNA文库。 基因文库：由大量的含有基因组DNA的不同DNA片段的克隆所构成的群体。 2、 λ噬菌体载体 （一）插入型载体 1、λgt10载体 43340bp 插入大小：设计为6kb，理论为7.6kb Att及其左侧缺失（b527），以及基因至cⅡ基因之间的突变 只有相当于cⅠ基因内有一个EcoRⅠ位点 用于克隆小的（～6kb） cDNA而设计，外源DNA量有限时较好，克隆效率高 2、 λ噬菌体载体 cⅠ 失活： cⅠ －在hflA（高频溶源化）中形成噬菌斑； cⅠ ＋在hflA中形成溶源，产生混浊噬菌斑， cⅠ ＋的生长受寄主的抑制50－100倍 λgt10载体的结构示意图 2、 λ噬菌体载体 2、λgt11载体 43.7kb 插入大小：0-7.2kb 在最左侧替代区置换一段lac5基因，其编码区终止密码子之前有一个EcoRⅠ位点（53bp上游） 筛选：在lac－寄主菌中，非重组噬菌斑为蓝色（IPTG） 用于构建cDNA文库、基因组文库、表达融合蛋白（外源DNA片段有可能与lacZ的阅读框相吻合，表达融合蛋白，可用免疫学方法筛选） 2、 λ噬菌体载体 cⅠ ：温敏突变 用来控制噬菌体的复制和融合蛋白的表达 λgt11载体的结构示意图 2、 λ噬菌体载体 一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构建基因组文库。 cos cos left arm central stuffer right arm 填充片段：含?DNA和其它外源DNA，来自E.coli或动物 （二）置换型载体 2、 λ噬菌体载体 A、EMBL3 和 EMBL4 这两个载体大小为 4