甜菜夜蛾酶活力测定方法版.docVIP

甜菜夜蛾酶活力测定方法 Ⅰ 仪器 酶标仪 型号：Molecular Devices公司生产的VERSA max 普通酶标仪和SPECTRA MAX GEMINI XS 荧光酶标仪 Ⅱ 试剂 匀浆液 0.1M PH 7.6的匀浆缓冲液 100mM PMSF（FW:174.19） 匀浆液=100mM PMSF与0.1M PH 7.6的匀浆缓冲液按1/100比例配制 0.1M PH 7.8 磷酸缓冲液 0.2M PH 6.0 磷酸缓冲液 0.1M PH 7.6 磷酸缓冲液 0.01M PH 7.4磷酸缓冲液（用于蛋白标定） 9.6mM的NADPH（现配现用） 6mM GSH（现配现用） 100mM x-NA（FW：186.21）乙醇溶液（4℃冰箱保存） 反应所需的底物 2mM PNA （现配现用） 0.01mM MROD （现配现用） 0.5mM ECOD （现配现用） 1.2mM CDNB （现配现用） 1.2mM DCNB （现配现用） Ⅲ 试剂的配制方法 1.匀浆液的制备 100mM PMSF与0.1M PH 7.8的匀浆缓冲液按1/100的比例配制 ①0.1M PH 7.6的匀浆缓冲液配制500ml（含1mM EDTA 1mM DTT 1mM PTU 1mM PMSF，20%甘油 ）： Na2HPO4·12H2O (FW:358.14) 15.579g NaH2PO4·2H2O (FW:156.01) 1.014g EDTA (FW:372.24) 0.186g PTU (FW:152.21) 0.076g 不溶于水，用前先用乙醇溶解。 DTT (FW:154.25) 0.077g 用前恢复至室温（-20℃冰箱） PMSF (FW:174.19) 现用现配 ②100mM PMSF（FW:174.19）的配制：称17.4mg PMSF 加入1ml 乙醇，涡旋混匀（PMSF见光易分解，于-20℃保存）。 （x\174.19 ×1000）\（1\1000）=100 x=0.017419g 一般称取174.1mg PMSF 加入10 ml乙醇，涡旋混匀后，分10管分装，用锡箔纸包好，放-20℃保存。 2. 0.1M PH 7.8 磷酸缓冲液配制500ml：（不需调PH） Na2HPO4·12H2O (FW:358.14) 16.385g NaH2PO4·2H2O (FW:156.01) 0.633g 3. 0.2M PH 6.0 磷酸缓冲液配制500ml：（不需调PH） Na2HPO4·12H2O (FW:358.14) 4.405g NaH2PO4·2H2O (FW:156.01) 13.682g 4. 0.1M PH 7.6 磷酸缓冲液配制500ml：（不需调PH） Na2HPO4·12H2O (FW:358.14) 15.579g NaH2PO4·2H2O (FW:156.01) 1.014g 5. 9.6mM的NADPH（FW：833.4）的配制（现配现用）： 根据自己的用量配制，用0.1M PH 7.8 PBS溶解，冰上保存。 6. 6mM GSH（FW：307.33）配制（现配现用）： 根据自己的用量配制，用0.1M PH 7.6 PBS 定容。 7. 100mM x-NA（FW：186.21）乙醇溶液的配制： 称0.1862g x-NA于10ml容量瓶中，用0.1M PH 7.6 PBS 定容（4℃保存备用）。 （x\186.21 ×1000）\（10\1000）=100 x=0.1862g 底物母液的配制： 8. 400mM PNA（FW:153.15 ）母液的配制：称取0. 6126g PNA溶于10ml的无水乙醇 （x/153.15 ×1000）\（10/1000）=400 x=0. 6126g 9. 1mM MROD（FW: 227.20）母液的配制：称取0.0009g MROD溶于二甲基亚砜（PMSO）。 （x/227.20×1000）/（1/1000）=1 x=0.00023g 10. 20mM ECOD母液（FW:190.20 ）母液的配制：称取0.0038g ECOD溶于1ml的无水乙醇 （x/190.20×1000）/（1/1000）=20 x=0.0038g