核酸提取及常见问题分析ok.pptxVIP

内容第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、　原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策前言 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。第一部分：DNA提取方法简介第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、　原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策DNA提取的几种方法　基因组DNA的提取　CTAB法　SDS法　其它DNA提取的几种方法　非基因组DNA的提取　质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法　　线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法基因组DNA－ CTAB法　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。基因组DNA－ CTAB法　CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl（pH8.0）　EDTA （pH8.0） NaCl CTABβ-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－ CTAB法　CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）　EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－ CTAB法　CTAB法流程图酒精沉淀植物材料裂解液液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解基因组DNA－SDS法 SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS法DNA提取缓冲液　组份Tris-HCl （pH8.0）　EDTA （pH 8.0 ）　NaCl SDS　终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%基因组DNA－SDS法抽提动物组织离心洗涤组织匀浆干燥溶解上层溶液DNA溶液酒精沉淀细胞裂解 SDS法流程图 （以动物组织为例） 基因组DNA－其它方法　根据细胞裂解方式的不同有：　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法　生物方式：酶法基因组DNA－其它方法　根据核酸分离纯化方式的不同有：　吸附材料结合法：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。　硅质材料　　阴离子交换树脂　磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。基因组DNA－其它方法　浓盐法：　　　有机溶剂抽提法：　　　密度梯度离心法：　利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒DNA－碱裂解法　碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA－碱裂解法　碱裂解法流程图对数期菌体上清液沉淀溶液I充分重悬抽提干燥溶解溶液II裂解酒精沉淀质粒DNA溶液溶液III中和离心洗涤质粒DNA－