副溶血性弧菌检测 水产品中致病性副溶血性弧菌的检测.doc

副溶血性弧菌检测 水产品中致病性副溶血性弧菌的检测 重庆医科大学 硕士学位论文 水产品中致病性副溶血性弧菌的检测 姓名：王宏萍 申请学位级别：硕士 专业：临床检验诊断学 指导教师：鲍依稀;周晓明水产品中致病性副溶血性弧菌的检测 摘要 副溶血性弧菌是食物中毒的重要病原菌。环境中９５％的副溶血性弧菌为非致病菌，５％为致病菌。判断水产品的食用合格性需要准确鉴定５％的致病菌。神奈川溶血反应曾作为致病性判定的标准，但该试验操作繁琐，易产生假阳性。耐热性溶血毒素作为副溶血性弧菌致病性的主要毒力因子，可由ｔｄｈ基因的检出来判断菌株的致病性。该方法尚未在国内进行应用。本研究建立了一个以１６ＳｒＤＮＡ序列分析鉴定副溶血性弧菌，以ｔｄｈ基因测定的ＰＣＲ和实时荧光定量ＰＣＲ反应体系定量反映副溶血性弧菌致病性的方法，并与神奈川溶血反应，脲酶反应进行比较。使用１６ＳｒＤＮＡ分析临床分离的１８１株常见菌作为对照，对３９株副溶血性弧菌进行测定；３６／３９株副溶血性弧菌的鉴定结果与生化培养法相符，对临床分离菌株均无误判。对９７株腹泻患者来源和７５株环境来源分离的副溶血性弧菌进行ｔｄｈ基因测定，神奈川溶血反应和脲酶反应。腹泻患者和环境来源菌株的ｔｄｈ基因检出率有显著差异（８３．５１％Ｗ１３．７０％，Ｐ＜０．００１）。神奈川溶血反应和脲酶反应的区分能力低于ｔｄｈ基因检测。建立了一个实时荧光定量ＰＣＲ反应以测定ｔｄｈ基因拷贝水平，定量公式为Ｙ＝．３．１４４１０９ｘ＋４３．２２９（Ｒ＝０．９９７，Ｐ＜０．００１）。 关键词：副溶血｜生弧菌，１６ＳｒＤＮＡ序列分析，ｔｄｈ基因，实时荧定量ＰＣＲ，神奈川溶血反应 资助渠道：本课题受上海市科委技术标准专项０６ｄｚ０５０２９资助以及上海申康医院发展中心病原体检测技术平台资助 ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｉｎＡｑｕａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔ＆ｕｓｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｐａｔｈｏｇｅｎｆｏｒｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎｃａｓｅｓ．Ｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓｈａｄｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈａｔ５％ｏｆＶｉｂｒｉｏ ｗｅｒｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ，ｗｈｅｒｅａｓｍｏｒｅｔｈａｎ９５％ｏｆｉｓｏｌａｔｅｓ ｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ．Ｔｈｕｓ，ｉｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＶｉｂｒｉｏ ｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｏｎｅｓ．Ｋａｎａｇａｗａ． ｔｅｓｔｈａｄｅｖｅｒｂｅｅｎｕｓｅｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ．Ｂｕｒｉｔｉｓｔｏｏｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄｔｏｂｅｒｅｐｅａｔａｂｌｅ． ｄｉｒｅｃｔｈｅｍｏｌｙｓｉｎ，ｗｈｉｃｈｉｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙｔｄｈｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎ ａｓｔｈｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｆｏｒｔｈｉｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｄｈ ｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｒｅｆｌｅｃｔｔｈｅｐａｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ．ｍｅｔｈｏｄｈａｄｎｏｔｙｅｔｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｉｎＣｈｉｎａ．Ｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａ１６ＳｔｅｓｔｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＨｂｒｉｏ ｉｓｏｌａｔｅｓ．ＴｈｅｓｅｔｅｓｔｓＳａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＫａｎａｇａｗａｈｅｍｏｌｙｓｉｎｔｅｓｔｏｒ ｔｅｓｔ．Ｔｈｉｒｔｙ—ｓｉｘｏｆ３９Ｈｂｒｉｏｐ口厂口办口Ｐ７”Ｄ纱ｆ纪“ｓｉｓｏｌａｔｅｓ（９２．３０％）ＳＯ ｔｅｓｔｅｄｂｙ１６ＳｒＤＮＡｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＨｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，３ｆｏｏｄｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｗｅｒｅｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎＨｂｒｉｏＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｒｅｇａｒｄｅｄｇｅｎｅＴｈｉｓｒＤＮＡｔｄｈｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＨｂｒｉｏｕｒｅａｓｅｆａｒ 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｔｅｓｔｓ．Ｎｏｎｅｏｆ１８１ｃｌｉｎｉｃａｌｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｓｗａｓｍｉｓｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｔｏｂｅＨｂｒｉｏｐａｒａｈ