琼脂糖凝胶直接杂交快速鉴定低拷贝数转基因.pdfVIP

z 1998 25 (3) 生物化学与生物物理进展 lrog．Bio~t~ ．Bioph~． 。269 ● ’ ’ ‘’ ～ … ‘ ～ ’ i技术与方法 ； _ · · 一 ” … ．· … ． 1 · · 琼脂糖凝胶直接杂交快速鉴定低拷贝数转基因 卢一凡 田 毂)邓继先 (军事 军； 董 ； 所．北京100071) 摘要 采用常规的PCR方法检测低拷贝数转基因有一定困难 提出一种使用琼脂糖凝脏直接杂交的 方法，结果明确、简单可行，是转基因动物中低拷贝数转基因鉴定的一种较好方法 关键词 琼脂糖凝胶，杂交，低拷贝数基因，转基因 学科分类每—面 —— 转基因动物的建立 ，为生命科学研究提供 引物 2 了新的有力工具 ．然而由于该技术 的建立涉及 5． 动物胚胎技术、转基因技术和常规的分子生物 学技术等，使其难度大增．如何准确、快速鉴 定所产生 的动物是否整合有外源基 因，是转基 因动物建立中一项极为关键的一步．特别是整 围1显撇注射片段示意圈 合拷贝数极低时，检测难度大增．有时往往会 ■：人基因组Gc 基因：■ ：鼠WAP结构基因 造成漏检．本文报告了我们在转基因鼠的建立 一 ：鼠WAP基 因5和 3区 ． 中，探索出的一种快速鉴定低拷贝数转基因的 方法 1．3 琼脂糖凝胶直接杂交 1 材料和方法 a．用 HamHI (150U)对 由假孕鼠产生 的仔鼠剪尾提取基因组DNA 10 酶切过夜， 1．1 显微注射片段及转基因小鼠的建立 取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8h，3 转基因鼠的建立采用常规的显微注射法． -- 4V／cm．b．将 电泳槽板连 同凝胶置 50℃放 受精卵的获得以及卵的移植均按文献 [1]进 置 3h，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液 行 转 基 因的构件 为，小 鼠乳清 酸 蛋 白 (0．5 mol／L NaOH， 0．15 otol／L NaC1) (wAP)基因2．6kb的调控序列、3kb结构 20rain，转置 中和液 (0．5otol／LTris-Ha， 基因及 1．4kb的3区序列．以人基 因组 0 0．15mol／LN 1)20mln，将胶放于玻璃板 CSF基因1．5kb为 目的片段，将其插入wAP 上沥干液体 ，室温放置 30min c．干胶应立 基因启始密码子ATG前的KpnI位点，构建 即杂交．先将胶在水中泡一下，以利于操作． 成 8．7kh的注射片段 (图 1) d．将胶放人杂交液 (6x ，5×Denhardts， 1．2 转基因