细胞生物学技术 知识课件流式细胞术.ppt

1.3.4 流式分选 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、培养板) lasers 断裂点(充电) 高压偏转板 四路分选原理 电荷式分选装置 分选指标 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。 需要细胞数 目标细胞所占比例(%) 1 5 50 104 1.7 min 20 s 2 s 105 16.8 min 3.4 min 20 s 106 2.8 h 3.4 min 3.4 min 107 1.2 天 5.6 h 34 min 分选时间表(机器流速10000个/s时) 分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。 分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。 富集模式(enrich mode) 纯化模式(purify mode) 单细胞模式(single cell mode) 1.4 荧光抗体的选择 A 根据流式细胞仪选择抗体 流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定)。如FACSCalibur： 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。 488 FL1 BP 530/30 515-545 FITC、AF488 FL2 BP 585/42 564-606 PE FL3 670 LP ﹥670 PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7 635 FL4 BP 661/16 653-669 APC、AF647 B 根据抗原表达强弱合理选择抗体 不同的荧光素强度有所不同； 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE C 选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。 CD5 1.5 FCM数据存储、显示与分析 标准的FCM数据采用列表模式（list mode），记录了每个细胞的所有参数的信息。 每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为5×10000（字或双字）。 Event # FSC SSC FL1 FITC FL2 PE FL3 APC 1 100 500 10 650 4 2 110 505 700 700 6 3 90 480 720 670 10 4 95 490 15 720 15 …… FCM数据显示方式 单参数直方图(Histogram) 双参数数据显示： 散点图(Dot Plot) 伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot) 三维图(3D Plot) 常用分析软件 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express 直方图Histogram 细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。 Event # FL1 FITC 1 10 2 700 3 720 4 15 …… 0…………10…………100…………1000 Counts FITC荧 光强度 横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。 DNA倍体分析 抗原表达分析 Overlay图 散点图 散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。 FL1 FL2 散点图和伪彩图 等高图和密度图 等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。 密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。 假三维图和三维图 SSC-Height FSC-Height Counts SSC → CD45 → CD14 → 设门与数据分析 门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。 椭圆形 圆形 矩形 任意形状 R(Region，区域)。门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几个区域组合在一起：G=R1 and R2; G=R1 or R2; G=R1 not R2。 十字门 线性门 二、流式细胞术操作与技巧 流式细胞术操作流程： 培养细胞 血液骨髓 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞悬液 制备 荧光染色 上机检测 表型测定 细胞分选 继续培养 FISH PCR 统计学分析