家蚕tgf-β家族成员dpp和daw基因的功能分析-functional analysis of dpp and daw genes of tgf - β family members in silkworm, bombyx mori.docx

2.家蚕Bmdpp和Bmdaw基因表达谱分析为了探讨家蚕Bmdpp和Bmdaw基因的表达规律，通过实时定量PCR（Real-TimePCR）分析了Bmdpp和Bmdaw基因在家蚕五龄第3天不同组织(精巢、卵巢、脂肪体、头、丝腺、马氏管、血细胞、中肠和气管丛)的表达水平。结果显示，Bmdpp和Bmdaw基因在血细胞中表达量最高，其它组织中表达量均较低。3.家蚕Bmdpp和Bmdaw蛋白多克隆抗体制备和亚细胞定位分析为了分析Bmdpp和Bmdaw细胞定位特征，将Bmdpp和Bmdaw基因分别克隆进原核表达载体pET-28a(+)，在E.coli中诱导表达，并利用重组蛋白免疫小鼠，制备了抗Bmdpp和Bmdaw的多克隆抗体。Westernblotting实验证实制备多克隆抗体具特异性。细胞定位结果显示，Bmdpp和Bmdaw主要定位在BmN细胞的细胞质膜中。4.Bmdpp和Bmdaw基因对病原微生物的感染应答为了探讨Bmdpp和Bmdaw基因对细菌和病毒感染的免疫应答，分别利用核型多角体病毒（BmNPV）、质型多角体病毒(BmCPV)和灭活的黑胸败血芽孢杆菌（Bab）感染家蚕BmN细胞和4龄家蚕（大造）；用脂多糖（LPS）刺激家蚕BmN细胞，用灭活的大肠杆菌（E.coli）感染4龄家蚕（大造），按不同时间点分别收集对照组、诱导组的细胞和家蚕组织，提取总RNA，real-timePCR检测结果发现，在家蚕BmN细胞中，LPS、Bab和BmCPV刺激均可下调Bmdpp基因的表达，提升Bmdaw基因的表达水平；而BmNPV刺激会上调Bmdpp基因的表达水平，下调Bmdaw基因的表达。家蚕（大造）幼虫感染BmNPV48和72h后，血液中Bmdpp转录水平分别是对照组的4.4和45.9倍，Bmdaw的表达水平是对照组的0.5和0.02倍；家蚕幼虫感染BmCPV48后，中肠中的Bmdpp转录水平迅速提高至对照组的34倍，72后下降到与对照组几乎一致，而Bmdaw基因的表达水平与对照组无显著变化。5.调节Bmdpp和Bmdaw基因表达对BmNPV和BmCPV增殖的影响为进一步鉴定Bmdpp和Bmdaw基因的功能，根据基因的序列分别设计、合成了3条siRNA，转染家蚕培养细胞沉默Bmdpp和Bmdaw基因。分别将Bmdpp和家蚕TGF-β家族成员dpp和daw基因的功能研究中文摘要Bmdaw基因克隆进载体pIZT/V5-His，转染家蚕BmN细胞系，分别筛选过表达Bmdpp和Bmdaw基因转化细胞。然后，探讨调节Bmdpp和Bmdaw基因表达水平对BmNPV、BmCPV增殖复制的影响。感染48h后的real-time的检测结果显示，在过表达Bmdpp基因的转化细胞中，BmNPV和BmCPV的增殖水平有不同程度地下降；在过表达Bmdaw基因的转化细胞中，BmNPV的增殖水平明显下降，BmCPV的增殖水平却没有明显变化。而沉默Bmdpp和Bmdaw基因，可不同程度地提升BmNPV、BmCPV的增殖水平。由此推测Bmdpp和Bmdaw基因的表达可影响病毒在细胞内增殖复制。6.TGF-β信号通路与家蚕其它信号通路相关性分析昆虫体内主要存在Toll、Imd、JAK/STAT和RNAi4种病原体信号识别条免疫信号通路，为了探讨TGF-β通路对免疫通路可能的调节作用，我们分别选取了这4种通路的关键基因（spz、PGRP-LB、PGRP-LE、stat、SOCS2、SOCS6、ago2、drc2），利用real-timePCR技术，检测在了过表达Bmdpp和Bmdaw基因对免疫通路关键基因表达水平的影响。结果显示，过表达Bmdpp基因，BmSOCS2、BmPGRP-LB的表达水平分别上调了14和13倍，Bmdcr2基因的表达水平也有较明显上调。当过表达Bmdaw基因时，BmSOCS2基因的表达明水平与对照组相比下降了97，BmSTAT基因的表达明显也被抑制。7.Bmdpp和Bmdaw基因相互作用蛋白的筛选与鉴定为了研究Bmdpp和Bmdaw与家蚕BmN细胞的相互作用蛋白，采用免疫共沉淀技术从过表达Bmdpp和Bmdaw的家蚕BmN细胞中筛选互作蛋白，然后对与Bmdpp和Bmdaw互作的候选蛋白进行质谱鉴定，共鉴定了10种蛋白。信息分析结果显示，这些蛋白涉及到信号传导、细胞增殖分化、离子通道、卵巢发育、核苷酸降解、免疫应答、细胞周期与凋亡等各个方面。综上所述，本研究克隆了家蚕TGF-β信号通路中两个基因Bmdpp和Bmdaw，分析了Bmdpp和Bmdaw基因的主要序列特征和表达模式；明确了Bmdpp和Bmdaw基因对家蚕病原微生物诱导的应答反应；发现调节Bmdpp和Bmdaw基因的表达水平可显著性地影响BmNPV和BmCPV在细胞中的增殖；免疫共沉淀结果鉴定了在家蚕