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核酸制备的一般方法和原理 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。 第28页/共48页 核酸制备的一般方法和原理 DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂 也可使DNase失活。 第29页/共48页 核酸制备的一般方法和原理 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 第30页/共48页 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 第31页/共48页 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的去垢剂 SDS 脱氧胆酸钠 4-氨基水杨酸钠 萘-1.5-二磺酸钠 三异丙基萘磺酸钠 第32页/共48页 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。 第33页/共48页 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 苯酚 氯仿 盐酸胍 DEPC 第34页/共48页 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的酶制剂 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶 第35页/共48页 核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 第36页/共48页 第二节　离心分离技术 离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。 第37页/共48页 一、离心机的种类与用途 按用途分： 分析用、制备用、分析－制备用 按结构特点分： 管式、吊篮式、转鼓式和碟式 按离心机转速分： 常（低）速、高速、超速 第38页/共48页 1.常速离心机 又称低速离心机 最大转速：8000rpm 相对离心力：＜1×104g 主要用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣等固形物及粗结晶等较大的颗粒。 RCF=1.12×10-5×r×n2RCF=相对离心力r=旋转半径（厘米） n=每分钟转数 第39页/共48页 2.高速离心机 转速：1×104－2.5×104 rpm 相对离心力： 1×104－10×105g 主要用途：分离各种沉淀物、细胞碎片、较大的细胞器等 高速冷冻离心机 第40页/共48页 3.超速离心机 转速：2.5×104－8×104 rpm 相对离心力： 5×105g 第41页/共48页 二、离心分离方法的选择 离心分离的方法可分为二类： 　　1.差速离心 　　2.密度梯度离心 　 第42页/共48页 原理：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法，称为差速离心法。 当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液