PCR实行技术总结.doc

增加PCR的特异性： 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~60% c. 5端和中间序列要多GC,以增加稳定性 d. 避免3端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC (有人说：3 端最好是 GC/CG/CC/GG。)e. 避免3端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3端的错配g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并primer时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并primer,并使用 较高的primer浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al. * primer的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的primer和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证primer同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比primer的 Tm低5。 设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的primer。 有的是根据GC含量估算Tm。确定primerTm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测primer的杂交稳定性。大部分计算器程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及primer序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5，以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少primer二聚体和非特异性产物的形成。 为获得最佳结果，两个primer应具有近似的Tm值。primer对的Tm差异如果超过5，就会primer在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个primerTm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 2. stability of primers 定制primer的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。 primer产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制primer以干粉形式运输。最好在TE重溶primer，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核甘的水解。 primer的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的primer储存在-20。以大于10μM浓度溶于TE的primer在 -20可以稳定保存6个月，但在室温（15到30）仅能保存不到1周。干粉primer可以在-20保存至少1年，在室温（15到30）最多可以保存2个月。1.PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 2.假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致