il1β对兔髓核细胞生长及mmp9 ngf表达的影响-effects of il1β on the growth of rabbit nucleus pulposus cells and the expression of m mp9 ngf.docx

摘要 摘要 万方数据 万方数据 摘 要 目的： 通过对兔髓核细胞的培养，探讨炎性细胞因子 IL 一 1β对兔髓核细胞生长的 影响以及 NGF 和 MMP-9 蛋白表达的的影响。 方法： 1、通过培养兔髓核细胞，观察其形态，取对数期的髓核细胞，种植 96 孔 板中，用 MTT 方法通过酶标仪检测 OD 值，来探讨不同浓度（10ng/ml IL-1β、 20ng/ml IL-1β、40 ng/ml IL-1β、80ng/ml IL-1β）的药物作用下髓核细胞的活力。 2、细胞预培养融合达到 80%后，以每孔 3×105 传代至 6 孔板中，实验组四 孔，对照组一孔，于每孔上做好标记，培养 24 小时后更换 1%胎牛血清的培养 基，培养 12 小时，更换含 10%胎牛血清的新培养基 2ml；然后用 40ng/ml IL-1β 加入四个实验孔，分别孵育 24h、48h、72h、96h 后收集细胞，提取总蛋白，同 时设置空白对照组，用 10%胎牛血清的新培养基 2ml 培育 96h 后提取蛋白，应 用 Western blotting 检测同一药物浓度下加药后不同时间 MMP-9、NGF 蛋白的表 达。 3、细胞预培养融合达到 80%后，以每孔 3×105 传代至 6 孔板中，分成两组： 对照组 l 孔，试验组 4 孔。培养 24 小时后更换 1%胎牛血清的培养基，培养 12 小时。试验组分别予 10 ng/ml、20ng/ml 、40ng/ml、80ng/ml IL-1β含 10％FBS DMEM/F12 培养基处理，空白对照组培养在 10％FBS DMEM/F12 培养基中，48h 后收集细胞，提取总蛋白，用蛋白免疫印迹法检测 MMP-9、NGF 蛋白的表达 。 结果： 1、原代髓核细胞培养 72h 后可见其逐渐贴壁，呈不规则型、长梭形，多角 型，缓慢生长。5 天贴壁细胞逐渐增多，大部分细胞紧贴组织块生长，呈克隆状 分布，贴壁细胞占 50-80%，呈多角形或纺锤形，未贴壁的细胞或组织逐渐表现 呈空泡状，250 倍镜下可见细胞轮廓清楚，扁平透亮，胞核清晰。培养 7 天后显 微镜下见组织周围细胞数目明显增多，呈放射状分布，细胞生长迅速，2 周左右 贴壁髓核细胞细胞逐渐融合，排列紧密，呈“铺石样”。 2、MTT 结果显示：10ng/ml、20ng/ml 、40ng/ml、80ng/ml IL-1β对兔髓核 II 细胞活性无明显影响，四组药物处理组的细胞存活率与对照组相比无明显差异。 3、IL-1β可刺激兔髓核细胞表达 NGF 蛋白，并且其表达量随着 IL-1β刺激时 间的增加而增加，差异有统计学意义（P0.05）；但是不同浓度的 IL-1β刺激兔 髓核细胞 NGF 蛋白的表达量较对照组明显升高，但各个组之间 NGF 的表达量 无明显差异（P＞0.05）。 4、IL-1β可刺激兔髓核细胞表达 MMP-9 蛋白，并且其表达量随着 IL-1β刺激 时间的增加而增加，差异有统计学意义（P0.05）；但是不同浓度的 IL-1β刺激 兔髓核细胞 MMP-9 蛋白的表达量较对照组明显升高，但各个组之间 MMP-9 的 表达量无明显差异（P＞0.05）。 结论： 1、致炎细胞因子 IL-1β能够刺激兔髓核细胞 MMP-9、NGF 蛋白的表达，正 常的髓核细胞 MMP-13、NGF 蛋白则呈低表达状态。 2、经炎性细胞因子 IL-1β刺激的兔髓核细胞 MMP-9、NGF 蛋白的表达的量 与作用时间有关，与炎症因子浓度无明显关系。 3、在椎间盘源性腰痛患者椎间盘的病理生理改变中，炎性细胞因子能够刺 激椎间盘细胞 NGF 的表达，诱导神经纤维长入椎间盘内部及髓核组织，同时， 刺激椎间盘分泌基质金属蛋白酶，使椎间盘内部基质的降解与合成失衡，加速 腰椎间盘的退变。 . 关键词：盘源性腰痛；IL-1β；髓核细胞；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）；NGF III Ab Abstract ABSTRACT Objective: To explore the impact of pro-inflammatory cytokines IL-1β on the growth of nucleus pulposus cells and the influence of NGF and MMP-9 protein expression of nucleus pulposus cells. Methods: Withdraw and cultivate rabbit nucleus pulposus cells to observed their morphology, then grow the logarithmic phase of nucleus pulposus cel