胶内酶解质谱样品前处理.docx

胶内酶解质谱样品前处理-蛋白考染胶溶液配制：1、水：HPLC级；乙腈：HPLC级；乙醇：HPLC级；2、200mM NH4HCO3溶液：取NH4HCO3 790.6mg 加水溶解并稀释到50ml。稀释4倍得到50 mM NH4HCO3溶液，稀释8倍得到25 mM NH4HCO3溶液；3、25mM NH4HCO3的50%的乙醇-水溶液（考染脱色液）： 50%乙醇-水溶液和50mM NH4HCO3溶液等比例混匀；4、10%乙酸的50%乙醇-水溶液；5、DTT溶液：10mM DTT的25mM NH4HCO3溶液（1.54mg/ml，现配此浓度，-20℃保存须两天内用完）；6、IAA溶液： 55mM IAA的25mM NH4HCO3溶液（10.175 mg/ml，现配此浓度，避光保存，-20℃保存须两天内用完）；7、Trypsin 溶液：取储存于-80℃的分装浓缩酶溶液（浓度为100ng/ul（20ug到200ul），溶于50 mM NH4HCO3溶液中）,用50 mM NH4HCO3溶液稀释为10ng/ul，全程冰上操作；8、50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）；9、75%乙腈-水溶液（含0.1%三氟乙酸）；10、0.1%三氟乙酸-水溶液；11、50%乙腈-水溶液（含0.1%三氟乙酸）。12、避光新鲜配置脱色液(银染)：50 mM NaS2O3: 15 mM K3Fe(CN) = 1：1混合取胶用超纯水清洗胶块2次，用手术刀片切下胶上目标条带，用手术刀片充分切碎(1mm3大小，用HPLC级异丙醇和水分别洗涤手术刀和镊子)。第一天： 考马斯亮蓝染色凝胶的脱色 把切碎的胶块置于1.5ml管中（预先加入1ml考染脱色液，含25mM NH4HCO3的50%的乙醇-水溶液），室温震荡15-20min（在混匀仪中高速震荡混匀），重复2-3次，直至胶块无色，14000rpm离心1min, 去上清。加入1ml 10%乙酸的50%乙醇-水溶液在恒温混匀仪上室温震荡洗涤胶块2次，每次30分钟，去上清。加入1ml水，在恒温混匀仪上室温轻微震荡洗涤胶块胶块2次，每次5-10分钟，去上清。加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功能，下同）。Destain银染凝胶的脱色1.加 500μl脱色液，室温避光震荡5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复 1～2 次至胶块去除银染颜色。2.加 500 μl 50mM NH4HCO3，震荡 5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液，重复 1～2次至溶液无明显黄色。再加 500 μl 50%乙腈，震荡 5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液。3.加 500μl 50mM NH4HCO3，震荡 5～10min，14000rpm离心1min，弃去溶液。再加1ml 50%乙腈，震荡 5～10 min，14000rpm离心1min，弃去溶液，至胶块呈白色。5. 加乙腈1ml漩涡混合洗5min，弃液，真空抽干10min（1308室Christ冻干仪，使用浓缩功能，下同）。 还原烷基化5. 加入 30-60ul (可适当多加，没过胶条) DTT溶液，56℃ 恒温混匀仪上震荡孵化1小时，冷却至室温，离心去上清，真空抽干10min。6. 加入 30-60ul IAA溶液(体积与DTT大体相同)，暗处室温孵育45min，去上清。加1ml 50 mM NH4HCO3溶液震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。加1ml水震荡洗胶块10min，14000rpm离心1min,去上清。加乙腈1ml漩涡混合洗5min，14000rpm离心1min, 去上清，真空抽干10min。酶解把胶粒转移至0.6ml的离心管中，加入25～35ul Trypsin 溶液（酶与底物蛋白的质量比约为1:20～1:50），冰上放置10min，中间检查确保胶块完全浸泡在酶液中，如果没有充分吸胀，补加一定量的酶液（酶液体积根据胶块大小确定，稍多于胶水溶液状态体积）待溶液被胶块完全吸收，加10～20ul 50mM NH4HCO3， 37℃酶解16-20小时。第二天：肽段提取 10.吸出酶解液至新的0.6ml离心管中，加2-3倍于胶体积的50％乙腈-水溶液（含5%三氟乙酸）至原管中（视胶条大小而定），恒温混匀仪室温震荡15min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清转移至同一0.6ml离心管中，盖管标记。11.加2-3倍于胶体积的75%乙腈-水溶液（含0.1%三氟乙酸）中，恒温混匀仪室温震荡10min（不可漩涡离心混合），离心1min，吸取上清合并至上管中。12. 加2-3倍于胶体积的乙腈中，恒温混匀仪室温震荡5min（不可漩涡