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预防篇――兽医微生物学综合实验 实验一 病原性细菌常规检验技术 病原性细菌常规检验是兽医必须掌握的一项基本功，这直接关系疫病的发现与控制，本实验主要通过增菌培养基、选择培养基或鉴别培养基从病料中分离可疑沙门氏菌，经镜检，纯培养后，将其纯培养物回归实验动物，结合其生理生化实验指标及血清学反应特性作出最终判断，鉴定到属。 目的要求 了解采样、分离培养的基本原则。 熟悉沙门氏菌的形态及染色特性。 熟悉培养基的制备原则和方法。 掌握沙门氏菌的常规微生物学诊断方法。 内容与安排 阶段一 沙门氏菌的形态、培养特性的观察，实验材料的增菌与分离培养。 阶段二 识别菌落、作纯培养及三糖铁琼脂培养。 阶段三 进行动物实验与生化实验。 阶段四 血清学诊断。 阶段一 分离培养 材料与仪器 材料：不同种沙门氏菌致死动物的病料，氯化镁孔雀绿增菌液，四硫磺酸钠煌绿增菌液，亚硒酸盐胱氨酸增菌液，DHL平板，亚硫酸铋琼脂平板，常规染色用试剂及备品。 仪器：光学显微镜，温箱，天平，电热炉，高压蒸汽灭菌器，电热干燥箱。 实验方法 准备器材及配制本阶段所需培养基。 用病料中直接抹片，经革兰氏染色镜检观察可疑菌的形态。 取少量病料在无菌环境下，经研磨接种于氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液，42℃培养18-24h，或接种亚硒酸盐胱氨酸增菌液于37℃培养18-24h，同时将病料接种于亚硫酸铋琼脂平板和DHL平板，37℃培养18-24h。 将增菌培养物接种于亚硫酸铋琼脂平板和DHL平板，37℃培养18-24h。（如病料直接分离培养成功，4可省略。） 观察菌落形态及染色特性。 结果要求 观察沙门氏菌的形态、大小与排列方式，掌握其染色特性。 掌握沙门氏菌在鉴别培养基中培养特性及菌落特征，注意与其它细菌的区别。 注意事项 所用用具和操作均需无菌。 染色涂片不宜太厚。 划线分离细菌不宜将琼脂划破。 思考题 不同种属沙门氏菌致病性有何区别？ 为何在分离培养前进行增菌？ 用病料涂片、染色与培养物涂片、染色的区别，及注意事项？ 阶段二 纯培养 材料与仪器 材料：获得沙门氏菌单个菌落的平板培养物，普通琼脂斜面培养基、三糖铁培养基。 仪器：同阶段一 实验方法 将获得沙门氏菌单个菌落接种于普通琼脂斜面培养基，37℃培养24h。 经革兰氏染色镜检培养物纯度。 将获得纯培养物接种于三糖铁培养基，37℃培养24h。 结果要求 镜检培养物纯度，观察多个视野，确认无其他杂菌后进行后续实验。 接种三糖铁培养基时，先斜面化线，后高层穿刺，注意观察培养后培养基的变化。 注意事项 所用用具和操作均需无菌。 染色涂片不宜太厚。 注意三糖铁培养基的制备、接种及观察。 思考题 纯培养的目的及意义？ 何谓三糖铁培养基，用其如何区分肠杆菌科的不同成员？ 阶段三 动物实验及生化实验 材料与仪器 材料：沙门氏菌的纯培养物、灭菌生理盐水、小白鼠、鸡等无沙门氏菌实验动物、鉴别沙门氏菌所用生化培养基、各种常用生化试剂（醋酸铅试纸条、MR试剂、VP试剂、吲哚试剂等）。 仪器：温箱、注射器等 实验方法 将确定为无杂菌的沙门氏菌纯培养物，用生理盐水经适当稀释后，分别采用腹腔注射和肌肉注射小白鼠和鸡，与健康动物隔离饲养，随时观察变化。 同时将沙门氏菌纯培养物接种普通肉汤培养基（H2S生成实验）、葡萄糖蛋白胨水2支（VP、MR实验）、蛋白胨水（吲哚实验）五种糖发酵管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、柠檬酸盐琼脂（硝酸盐利用实验），37℃培养2-3天。 滴加相应的生化试剂，观察生化实验结果。 结果要求 随时观察接种实验动物的变化，观察出现的临床症状，剖检后观察病变部位，判断是否符合沙门氏菌的致病特征，取样染色镜检。 观察生化培养基的变化，记录结果，判断是否符合沙门氏菌的生化特性。 注意事项 注意实验动物的保定与隔离饲养。 生化实验中糖发酵管均为穿刺接种。 思考题 常用实验动物有哪些，分别如何保定、接种？ 区别大肠杆菌和沙门氏菌常做的生化实验包括哪几种？ 阶段四 血清学实验 材料与仪器 材料：沙门氏菌的纯培养物，玻片，沙门氏菌的多价O血清（A-F群），O因子血清，H因子血清，接种环或牙签。 实验方法 通过玻片凝集实验利用沙门氏菌的多价O血清，初步诊断可疑菌是否为沙门氏菌。 利用O因子血清判断其O抗原组成。 利用H因子血清判断其H抗原组成。 根据被检菌的O、H抗原对照抗原表，即可确定被检菌为哪种沙门氏菌。 每做一个凝集实验，以生理盐水代替血清做对照。 结果要求 与空白对照比较判定凝集情况。 做最后判定时结合各阶段实验结果给予定论 注意事项 各实验的内在联系。 在实践中根据具体情况决定采用哪几项实验进行检验。 思考题 沙门氏菌有几种抗原，根据抗原如何分群？ 将沙门氏菌鉴定到型需做那些检验项目？附：沙门氏菌鉴定程序 实验二 病原快速检测