原核蛋白可溶性表达策略及实验方案.PDFVIP

活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 原核蛋白可溶性表达策略及实验方案 可溶性表达策略 大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为 3种 ：第 1种为胞外分泌 ，即目的蛋白被分泌到培养基中。 这种方式表达的蛋白容易纯化 ，不易降解 ，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外 ；第 2种为周质空间表达 ， 这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中 ，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠 ，在向外周质转移的过程中 ， 信号肽在细胞内剪切 ，更有可能产生目的蛋白的天然 N末端 ；第 3种为胞内表达 ，这种表达易形成无活性的包涵 体 ，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。 因为多数蛋白不能够进行分泌表达 ，且表达量较少 ，所以分泌蛋白表达方法很少被使用 ；现阶段实验科研中常用的 方法是融合型蛋白表达 ，包括蛋白上清表达和包涵体复性 ，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。有关通过蛋 白复性获得可溶性蛋白请参见 《包涵体蛋白复性的方法操作》 ，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。 降低重组蛋白合成的速率 可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率 ，蛋白的折叠速率 ，以及聚集的速率。高水平表达时 ，肽链聚集的速率一 旦超过折叠速率 ，就会形成包涵体。因此 ，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。常用的方 法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。 密码子优化 密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛 选。经过优化的基因序列往往能提高 mRNA 二级结构的稳定性 ，有利于新生肽段的正确折叠 ，提高外源活性蛋白 的表达。值得注意的是 ，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响 ，在转录过程中稀有密码子的位置以及转 录的速率都会影响密码子的翻译 ，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。 启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。在胞内表达中 ，常采用 T7、PL等 强启动子 ，表达水平可达菌体总蛋白的 70%。若重组蛋白多以包涵体形式存在 ，可采用强度较弱的 lac等启动子以 达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。 表达温度的选择 Tel 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB ： （ ） 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 大肠杆菌的最适生长温度在 37～39℃之间 ，但此温度下极易生成包涵体蛋白 ，降低可溶性蛋白的表达 ，而低温培 养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。 由表可知 ：不同的外源蛋白低温表达时 ，可溶性蛋白的表达水平有明显提高。但培养温度有一定下限 （8～10℃ ）， 在此温度以下 ，蛋白基本上停止表达。降低培养温度有利于重组蛋白合成速率的降低 ，因为蛋白质的合成较慢 ，新 合成的蛋白质会有更充分的时间折叠 ，增加蛋白的正确折叠率的同时降低重组蛋白的降解速率。 培养基的组成 培养基的组成对可溶外源蛋白的表达有显著影响。一般情况下 ，蛋白表达采用合成培养基 ，但合成培养基往往又存 在菌体生长较慢和菌体浓度较低的问题。外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响 ，在诱导表达时期 ，需尽量保 持低水平的葡萄糖 ，可以用甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一。在诱导时 期 ，流加营养物质也有可能显著提高可溶蛋白表达。考虑以下几点也可以提高可溶性蛋白的表达量 ： 向培养基中添加蛋白抑制剂也能提高可溶蛋白量 ； 1. 外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程 ，向培养基中添加适量的金属离子 ，可能提高这些酶类的活性 ， 因此也能增加可溶蛋白的表达量 ； 2. 某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关 ，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提 高蛋白的可溶性和稳定性 ； 3. 良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的 CO2和乙酸的浓度 ，也有可能获得高产量的活