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X 射 线 蛋 白 质 晶 体 学 为了研究蛋白质与其大分 子配体的相互识别与作用的机 理（例如：研究蛋白质－DNA 相互作用、抗原抗体相互作用、蛋白质－结合蛋白的相互 作用等等），通常利用共晶法制备二者复合物的晶体。 实践经验表明，共晶法制 备复合物晶体对配体之间的亲 和力的要求并不是很高。 + ‖ 共晶 (co-crystallizing) 68 蛋白质晶体生长的共晶法(co-crystallizing) 浸泡法可能的用途： 为了研究蛋白质 与其小分子配体 (包括底物类似 物、活性抑制剂 等)的作用机理， 利用浸泡法制备 二者复合物的晶 体。 传统上，为了解决晶体衍射相位 问题的需要，可以利用浸泡法制 备蛋白质晶体的重原子衍生物。 X 射 线 蛋 白 质 晶 体 学 69 蛋白-蛋白复合物晶体不能运用浸泡法 作为浸泡法原理的扩展，可以将生物大分子晶体 “浸泡”在含有重原子的高压气体中。 生物大分子晶体 蛋白质晶体生长的浸泡法(soaking) 含有小分子配体的溶液 X 射 线 蛋 白 质 晶 体 学 71 同一种蛋白质可以在不同条件下生长成不同 晶型的晶体；可以在不同的条件培养出同一种晶型的蛋 白质晶体。 72 X 射 线 蛋 白 X-rays 质 晶 体 学 X-rays 液氮气流维持冷冻状态 液氮低温冷冻 使用相对不便，成本 偏高。但是，由于无玻璃 毛细管使得吸收效应大大 减少，而且晶体的低温冷 冻状态使其耐辐射能力大 大增加，有可能加大曝光 时间并收集尽可能多的衍 射画面。 密封的薄壁玻璃毛细管 残留的结晶母液 室温 使用比较方便，成本 较低。但是，由于封装晶 体的玻璃毛细管以及残留 的结晶母液对X射线的吸 收，使得衍射强度的测量 误差较大。 选择晶体的安装方式－－室温或者液氮低温冷冻 X-ray是由高速运动着的(带电或不带电) 粒子与某种物质相撞击后突然减速，且与该物 质中的内层电子相作用而产生的。 X-ray的产生需要有几个基本条件： 1.产生并发射自由电子 2.迫使自由电子作定向高速运动。 3.在电子运动的路径上设置使其减速的 障碍物 。 73 常用的X射线发生方法 The X-ray generator in the home laboratory 1）封闭的X射线管 （Sealed X-ray Tube） 2） 旋转阳极X射线管 （Rotating Anode X-ray Tube） 3）同步辐射（Synchrotron Radiation）装置 74 75 同步辐射： synchrotron radiation ，带电粒子在电磁 ? 场的作用下沿弯转轨道行进时所发出的电磁辐射 当速度接近光速的带电粒子在磁场中加速和改变运动方向 时，发射出的强电磁波。 ? 同步辐射光优点： 1）强度高 光的强度比旋转靶高102-106倍，光子能量高达6-40kev。这 样极大的缩短了收集晶体衍射数据的时间，记录一副静止 或回摆衍射画面，所需时间仅以秒计。并且极大的提高了 蛋白质结构测定的分辨率，可接近原子分辨率0.12nm或更 好。真正的可实现微小晶体的分析。 76 2）发散度小 发散度只有零点几毫弧度，而普通X射线为几度，因而通过 准直器后强度损失少，而且对晶体的损伤小，晶体衍射点 锐利，不弥散。尤其适合于晶胞大的晶体结构测定 同步辐射光优点： 3）波长可调 同步辐射X射线，为无特征光的白色射线，可调范围在0.1- 0.3nm，甚至可获得更短的小于0.1nm的X射线。即可满足多 波长反常散射实验和劳厄衍射研究的需要 78 4）脉冲时间结构 由于同步辐射是以束团形式发射，因而具有脉冲时间结构。 脉冲时间为10-12s数量级，两脉冲时间的时间间隔为10-8s， 因而可以用来研究生物大分子在10-6-10-12s时间间隔内的构 象变化，开展时间分辨晶体学研究。 铅 屏 X 射 线 管 底 片 晶体 晶体可看作三维 立体光栅 根据劳厄斑点的 分布可算出晶面间距 掌握晶体点阵结构 80 劳 厄 斑 点 4）BCA（二喹啉甲酸）法 原理：第一步，在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+ 反应形成复合物；第二步，BCA试剂与该复合 物反应，生成深紫色化合物，在562nm处有吸 收峰。 ? 优点：操作简便，线性范围20～2000 有试剂盒出售。 ?g/ml； ? 34 5）. 紫外分光光度法 原理：蛋白质中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽 键在215nm附近有特异吸收。可通过测定该波长的光吸 收度，计算蛋白质浓度。 ? C＝A/KL，其中A为吸光度，K为摩尔消光系数，L为光 程。 ? K值可通过各种方法得到（包括软件分析等）。 ? 35 优缺点 优点： ① 操作简便，且敏感度高 ? （2