§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为标记的二抗。 最常用的一种是酶联的二抗，印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。 在酶联抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。 另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 除了酶联二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，主要包括以下一些： I125标记的二抗：可以通过放射性自显影检测。 荧光素异硫氰酸盐标记的二抗：可以通过在紫外灯下产生荧光来检测。 I125标记金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）：Protein A