表达载体pET28a-monRII构建过程.PPT

1、转录调控因子monRII的EMSA实验已经完成，下一步需要确定具体结合位点。 2、调控基因monH关键区域的表达载体已经构建好，并纯化出可溶性蛋白，下一步需要进行EMSA实验。 3、调控基因monRI的表达载体已经构建好，下一步需要优化并纯化出可溶性蛋白。 3、结论 莫能菌素生物合成中 转录调控因子的分析 姓 名：逄爱萍 指导教师：赵广荣 日 期：2013年4月10号 肉桂地链霉菌莫能菌素生物合成基因簇 抗生素 转录因子 调控 通过分析抗生素转录因子的调控作用，进而 对菌株进行改造，可以提高抗生素的产量。 1、目标基因的克隆：从S. cinnamonensis克隆monRI、monRII 、monH基因。 2、表达载体的构建：选择合适的载体，将上述基因与启动子、终止子等连接，构建高效表达载体。 3、蛋白的优化表达与纯化：将载体转化到大肠杆菌中，优化表达条件，纯化可溶性蛋白。 4、转录因子与核酸的杂交：通过EMSA实验，确定与转录因子结合的启动子。 提取基因组 PCR获得 目的片段 构建表达载体 测序验证 电转到宿主菌 优化表达并 纯化可溶性蛋白 EMSA实验 技术路线 纯化质粒 提取质粒 monRII 的PCR产物电泳（左） pET28a-monRII 酶切电泳（右） 1、表达载体pET28a-monRII构建过程 1：37℃，1.0 mmol/L，包涵体； 2：37℃，1.0 mmol/L，上清；3：37℃，0.8 mmol/L，包涵体； 4：37℃，0.8 mmol/L，上清；5：30℃，1.0 mmol/L，包涵体； 6：30℃，1.0 mmol/L，上清； 7：30℃，0.8 mmol/L，包涵体；8：30℃，0.8 mmol/L，上清；M：protein marker 1、BPES362/pET28a-monRII 1：孵育后； 2：第一次洗涤； 3：第二次洗涤； 4：第三次洗涤； 5：第四次洗涤； 6：第五次洗涤； 7：第一次洗脱； 8：第二次洗脱；M：protein marker 用Ni-NTA树脂纯化BPES362 BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化（37℃，IPTG=1.0mmol/L） 用Ni-NTA树脂纯化BPES362 1：第九次洗脱； 2：第八次洗脱； 3：第七次洗脱； 4：第六次洗脱； 5：protein rulerII； 6：第五次洗脱； 7：第四次洗脱； 8：第三次洗脱 BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化（37℃，IPTG=1.0mmol/L） 目的蛋白 莫能霉素启动子的标记实验 从图中可以看出，启动子浓度在15.5fmol/ul时，标记后依然清晰可见。因此，选定启动子浓度为15.5fmol/ul做EMSA。 EMSA实验 启动子T 启动子E 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 结合 未结合 启动子AI 1 2 3 4 5 6 启动子AIX 1 2 3 4 5 6 启动子AVII 1 2 3 4 5 6 启动子D 1 2 3 4 5 6 启动子AX 1 2 3 4 5 6 启动子RII 1 2 3 4 5 6 结论：只有启动子E和T与转录因子monRII结合。 2、表达载体pET28a-monRI构建过程 monRI 的PCR产物电泳（左） pET28a-monRI 酶切电泳（右） 1：1.0 mmol/L，包涵体； 2：1.0 mmol/L，上清；3：0.8 mmol/L，包涵体； 4：0.8 mmol/L，上清；5：0.6 mmol/L，包涵体； 6：0.6 mmol/L，上清； 7：0.4 mmol/L，包涵体；8：0.4 mmol/L，上清；9：空白对照；M：protein marker 3、BPES361/pET28a-monRI（37℃） 1：0.1 mmol/L，包涵体； 2：0.1 mmol/L，上清；3：0.3 mmol/L，包涵体； 4：0.3 mmol/L，上清；5：0.5 mmol/L，包涵体； 6：0.5 mmol/L，上清； 7：0.8