第2章 基因工程-(2学时).pptVIP

第一节 基因工程理论的研究基础 第二节 基因工程基本技术路线 第三节 常用的工具酶和载体 第四节 目的基因片段的获取 第五节 目的基因导入受体细胞 第六节 克隆子的筛选和鉴定 第一节 基因工程理论的研究基础 染色体是遗传物质的载体。 “基因”一词的创立：1909年，丹麦遗传学家约翰逊提出了“基因”（gene）一词。 “基因型”与“表现型” 术语，初步阐明基因与性状的关系。不过此时的基因仍是一个未经证实，仅靠逻辑推理得出的概念。 基因工程研究的理论依据： 不同基因具有相同的物质基础 基因是可以切割的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 第三节 常用的工具酶和载体 3.1 工具酶 （一）限制性核酸内切酶： (二）DNA连接酶： （三）DNA片段末端修饰酶： (四) DNA聚合酶 （2）限制性核酸内切酶种类 I型酶：它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链 II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带 III型酶：它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。 （3）限制性核酸内切酶的命名 根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。 第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母 第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母 第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母 罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 从一种微生物中发现了几种 限制酶，按发现顺序排列 如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichia coli）R株分离得到的第一种限制酶。 (5)酶切反应体系 (6)常用的酶切方法： 单酶切 双酶切 部分酶切：底物浓度低，识别序列的甲基化，酶用量不足，反应时间不够以及反应缓冲液 （二）DNA连接酶 DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶。 催化两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。 (1)DNA片段之间的连接 （a）具有互补粘性末端片段之间的连接： T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶 （b）具有平末端DNA片段之间的连接： T4 DNA连接酶； （c）DNA片段末端修饰后进行连接： 核酸外切酶：切成平末端 末端转移酶：修饰成互补黏性末端 碱性磷酸酶：将5’-P修饰成5’-OH （d）DNA片段加连杆后连接 人工合成连杆或衔接头 （四）DNA聚合酶 （1）要有底物4种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA; （2）必须有模版； （3）需有引物，不能自行其起始合成新的DNA链； （4）催化dNTP加到生长中的DNA链的3’－OH末端，DNA的合成方向是5’ →3’。 PCR反应 小结： 1. 基因克隆（DNA重组）的基本流程 2. 常用工具酶：限制性核酸内切酶及其作用；DNA连接酶种类及其作用；DNA末端修饰酶（末端转移酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等及其作用） * * 生 物 技 术 Biotechnology 第二章 基因工程 （Gene Engineering） 基因工程概念： 应用人工方法把生物的遗传物质（DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；或者使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 基因工程技术的一般步骤 基因结构示意图 ＋链5’ －链3’ 上游 3’ 5’ 第二节 基因工程的一般步骤 生物材料 RNA DNA mRNA cDNA文库 基因组文库 人工合成 目的基因 克隆载体 重组DNA 受体细胞 克隆子 转基因生物 (一)限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） （1）限制性核酸内切酶定义 一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有3’－OH和5’－P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。 H i n d III Haemophilus influenzae d 属名 种名 株名 嗜血流感杆菌d株 发现的第三种限制 性内切酶 （4）限制性内切酶作用模式图： （a) 产生5′突出粘性末端(sticky end) EcoR I **********GA