卤醇脱卤酶的表达 改造及其在r-expression modification of halohydrin dehalogenase and its application in r.docx

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浙江工业大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师的指导下,独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外,本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均 已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。作者签名:日期:年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借 阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□,在年解密后适用本授权书。2、不保密□。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名:日期:年月日导师签名:日期:年月日卤醇脱卤酶的表达、改造及其在(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯合成中的应用摘 要卤醇脱卤酶能够催化邻卤代醇化合物脱卤形成环氧化物,并释放 卤素离子和质子;另外,卤醇脱卤酶也可以催化亲核试剂开环环氧化 合物形成?-取代醇。卤醇脱卤酶介导的催化反应具有高效性、高立体 选择性和高区域选择性,使其在手性卤代醇、环氧化物、?-取代醇等 化合物的合成中占有重要地位。(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(HN)作为 一种重要的?-羟基腈化合物,是合成阿托伐他汀钙等降血脂药物的重 要中间体。由于卤醇脱卤酶催化合成 HN 的过程具有反应条件温和, 反应步骤简短,产物收率高等优点,该工艺过程已得到越来越多的科 研工作者的重视。本论文围绕卤醇脱卤酶合成 HN 的过程展开研究, 主要包括以下研究工作:论文首先利用基因挖掘的方法从短链脱氢/还原酶的基因数据库 中筛选了六条与卤醇脱卤酶氨基酸序列同源性较高的酶基因,通过克 隆表达 和 活 力 分 析 证 明 来 自 嗜 清 洁 细 小 杆 菌 ( Parvibaculum lavamentivorans DS-1)的 SDR6 基因在 E. coli BL21(DE3)/pET-32a(+) 系统中的表达产物显示出卤醇脱卤酶活力。氨基酸序列同源性比对分 析显示 SDR6 与已报道的 3 类卤醇脱卤酶的同源性均在 30%左右,为I一类新型的卤醇脱卤酶,并命名为 HheD。后续对 HheD 进行了表达纯化和酶学性质的表征,包括底物谱分析、金属离子对酶活力的影响、 动力学拆分环氧化物等。此外,利用全基因合成的方法克隆表达了已 报道的卤醇脱卤酶 HheAAD2、HheBGP1 和 HheC,与 HheD 共同建立卤 醇脱卤酶酶库。研究了卤醇脱卤酶催化 1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)合成(S)-4-氯-3- 羟基丁腈[(S)-CHBN]的过程。经过酶的筛选,发现 HheC 在催化 1,3-DCP 合成(S)-CHBN 的过程中显示出较好的活力和立体选择性。 通过催化条件的优化和定点突变研究,实现了 HheC 突变体 W249F催化 10 g/L 1,3-DCP 转化合成(S)-CHBN,收率为 86%,ee 值为 97.5%; 通过 HheC 突变体 W249F 和 W249F/W139D 的协同催化,实现了 20 g/L 1,3-DCP 转化合成(S)-CHBN,收率为 86%,ee 值为 96.9%。研究了卤醇脱卤酶催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]合成 HN 的过程。经过酶的筛选,发现 HheD 在催化(S)-CHBE 合成 HN 的 过程中显示最佳的催化效率。通过对反应体系的温度和 pH 的优化, 确定其最佳的反应温度为 40℃,最适 pH 为 8.0。在此条件下,使用 40 g DCW/L 的 HheD 全细胞催化 200 g/L (S)-CHBE 转化合成 HN,反 应 14 h,(S)-CHBE 转化率为 95%,HN 的收率为 85%。基于叠氮离子的比色分析,建立卤醇脱卤酶活力测定的高通量方 法,并用于 HheD 的定向进化过程。通过 error-prone PCR 建立随机突 变文库,从 2500 个突变体中筛选获得优良突变体 F176M、A187R 和 A187S,其活力相对于野生型 HheD (HheD-WT)分别提高 2.1、1.8II和 1.6 倍。将突变位点进行组合后,得到突变体 F176M/A187R 和F176M/A187S,其相对活力分别提高了 3.1 和 2.1 倍。表达纯化 HheD 及其突变体 F176M/A187R,测定其在催化(S)-CHBE 合成 HN 过程中 的动力学参数,结果显示 F176M/A187R 催化合成 HN 的催化

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