2012全国分子细胞生物学实验技术培训班—Western blot 技术讲座.pptVIP

不连续电泳 凝胶层的不连续性：浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。 缓冲液离子成分和pH的不连续性：在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。 浓缩胶 分离胶 5% pH6.8 12% pH8.8 步骤三 SDS张和胶一样大小的PVDF膜（甲醇活化）， 然后放在转移缓冲液中浸泡10min 转膜用的夹子，一支玻棒 两块海绵垫，滤纸 转膜缓冲液 转膜材料准备 铺滤纸 铺胶 铺膜及滤纸 固定于转移槽 转膜 将夹子打开使黑的一面保持水平 在上面垫一张海绵垫 在海绵垫上铺两层滤纸 用玻棒擀去其中的气泡 将玻璃板撬掉，轻轻刮去浓缩胶 小心剥下分离胶，在转移缓冲液中浸泡 取出盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡 将膜盖于胶上，然后除气泡 在膜上盖2张滤纸并除去气泡 最后盖上另一个海绵垫，合起夹子 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面 在槽的一边放一块冰来降温； 接通电源，开始转膜 电转时间： 90V 1-2h，可根据蛋白分子量的大小灵活选择 步骤四 转印 转膜注意事项 注意事项： 1.转移单元无气泡 2.注意方向/ 3.戴手套，防止蛋白污染 4.胶和膜大小要一致 步骤五 封闭 作用：为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景； 用5％脱脂奶粉或5％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制）