感受态细胞制备及转化.docxVIP

感受态细胞的制备 实验原理 受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。 材料及准备工作 一）材料准备 试剂、耗材名称品牌货号蛋白胨酵母提取物氯化钠琼脂粉聚乙二醇（PEG8000）DMSOMgCl2KClCaCl2氨苄青霉素摇菌管平皿（10cm）500ml锥形烧瓶枪头（1ml，0.2ml）0.22μm过滤器50ml注射器 二)试剂配制 1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用） 蛋白胨2.0g酵母提取物1.0g氯化钠（NaCl）2.0g 2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌） 蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液（100ml）（有效期2周） 聚乙二醇（PEG8000）10g终浓度10%DMSO5ml终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml终浓度50mmol/LLB85ml终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用） KCl（2mol/L）2.5mlCaCl2(1mol/L)1.5mlMgCl2(1mol/L)2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒） 5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml） 取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用 三）仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计 9、微量移液枪 10、低温冰箱 步骤及注意事项 一）感受态制备（TSS法） 1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）； 2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜； 3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）； 4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌； 5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态； 6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。 二）KCM法转化 1、冰上融化1管感受态细菌（也可室温化解后，再迅速冰浴）； 2、重取1个1.5ml离心管，加入20μl 5×KCM，DNA（建议不要超过10ng），水至100μl，放置冰中； 3、加入100μl 感受态细菌，混匀，继续冰中放置20-30mins； 4、42 ℃ 热休克 90s后，再插入冰中1-5min；（休克30s效果更好） 5、加入1 ml 37℃预热的LB（无氨苄），转移至摇菌管中，220rpm ，37℃ 孵育1h； 6、取100μl菌液，接种于含抗生素的LB平皿（也可以把菌液2000 rpm离心5 min，收集细菌，用预热LB重悬细菌，接种含抗生素的LB平皿上），37℃ 孵育过夜。 7、剩余的感受态，可做阴性对照。 三）注意事项 1、本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。 2、PEG 和MgCl2二者均可沉淀质粒DNA，且PEG 有使细胞壁具有穿透性, 允许DNA 进入细菌体内的生物学功能；这些可能是优于CaCl2 法的原因。 3、培养基PH值。pH值在6.8-7.2之间较好。保证菌摇好后，pH值不低于6.0。pH值在6.5以上，表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。 4、培养基离子浓度。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。使用20mmol/L MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。 5、培养温度。文献及经验证明，较低的温度培养有利于感受态的形成（一般18℃,一般的感受态，用室