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淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育
功能微生物(淀粉酶产生菌)的筛选、培养与选育程雅楠
摘要:以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标,通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程,并测定了诱变后菌株的16s序列,初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。
关键词:产淀粉酶细菌 筛选 选育 诱变育种
淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一,为了提高淀粉酶的生产水平,首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株,对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变,筛选出产量高、性状优良的突变菌株。淀粉酶主要来源于植物和微生物,并通过发酵完成生产,因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌,通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
材料和方法
材料
1.1.1 来源:南师大北区教学楼附近的土壤。
1.1..2培养基:淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L,蛋白胨 10g/L,NaCl 5g/L,可溶性淀粉2g/L,琼脂 20g/L,pH7.0~7.2。②液体培养基:牛肉膏 3g/L,蛋白胨 10g/L,NaCl 5g/L,可溶性淀粉2g/L,琼脂 20g/L,pH7.0~7.2。优化条件培养基配制:①淀粉3g/L,蛋白胨 10g/L, K2HPO4 1.5g,MgSO4·7H2O 1.5g, pH 4.0 。②淀粉3g/L,蛋白胨 10g/L, K2HPO4 1.5g,MgSO4·7H2O 1.5g, pH 7.2 。碳源培养基:①淀粉 3g,蛋白胨 10g,K2HPO4 1.5g, MgSO4·7H2O 1.5g,去离子水 1000mL pH 7.2。②葡萄糖3g,蛋白胨 10g,K2HPO4 1.5g,MgSO4·7H2O 1.5g,去离子水 1000mL pH 7.2。氮源培养基: ①硝酸钠10g,淀粉3g,K2HPO4 1.5g,MgSO4·7H2O 1.5g,去离子水 1000mL pH 7.2②硫酸铵 10g,淀粉3g ,K2HPO4 1.5g,MgSO4·7H2O 1.5g,去离子水 1000mL pH 7.2。
1.1.3 仪器设备:全自动高压蒸汽灭菌釜,手提式高压蒸汽灭菌釜,电子台秤,普通天平
产淀粉酶细菌的分离筛选
1.2.1 制备土壤稀释液:称取土壤2g,放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中,振荡5min,即为稀释10-1的土壤悬液。然后在离心管中依次稀释至10-3、10-4 稀释度。
制备淀粉培养基平板,制5块淀粉培养基平板,倒入融化好的淀粉培养基(温度为不烫手为宜)并轻轻摇晃混匀,置于桌面冷却为平板。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
1.2.2吸取稀释液:无菌操作法分别吸取10-3、10-4 土壤稀释液0.1mL,分别加在已制好的2块淀粉平板培养基上。
1.2.3涂板:用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平,静置5min
划线分离:将10-1 土壤稀释液用接种环挑取一环,在一块淀粉培养基上进行划线分离。然后倒置于恒温箱培养。看演示
培养:倒置于房间30℃恒温箱培养24小时。
1.2.4筛选:24小时后,在之前稀释涂布和划线的3块淀粉培养基上选取典型细菌菌落(尽量选取边缘整齐和规则的菌落),并用记号笔进行编号。3块淀粉培养基上,观察是否有水解圈的产生,并测量其半径。对照备用点种平板和编号菌落的水解圈大小,挑取水解圈最大的一个菌斑,用记号笔将其勾选出来。
1.2.5 分离:将编号后的菌落用无菌牙签挑取,在备用的1块淀粉培养基平板上分别点种。将点种平板继续置于30℃培养箱中培养。
产淀粉酶菌在不同培养条件下的生长状况
1.3.1 发酵液接种:提前24h将平板菌种用接种环挑取,在液体试管中打散混匀,然后按1%接种量分别转接①pH4 ②pH7.2 ③碳源淀粉 ④碳源葡萄糖 ⑤氮源硝酸钠 ⑥氮源硫酸铵 六种液体摇瓶发酵培养基。
1.3.2 菌种保藏:挑取平板菌落,在斜面试管培养基上划线,30℃培养,然后置冰箱低温保藏。
1.3.3 菌体生长量的测定:将培养24h后液体摇瓶培养物分别取出2mL于试管中,加入8mL蒸馏水,进行5倍稀释。将各稀释液分别倒入比色杯中,在721型分光光度计600nm波长下测定吸光值(optical density,OD600值)。如果菌液浓度过大,可继续稀释后再进行测量,保证OD值应控制在0.1-1之间。分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小,评价对菌体生长量的影响。
1.3.4 不同条件对淀粉酶活性
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