淀粉酶产生菌的筛选、培养与选育.doc

功能微生物（淀粉酶产生菌）的筛选、培养与选育程雅楠 摘要：以产淀粉酶细菌的筛选和选育为目标，通过培养基制备及灭菌、菌种的分离筛选与纯化、菌种的鉴定、培养条件的优化以及淀粉酶产生菌的紫外诱变育种等五个过程，并测定了诱变后菌株的16s序列，初步掌握了对某菌种进行筛选、选育及诱变的必需步骤。 关键词：产淀粉酶细菌 筛选 选育 诱变育种 淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株。淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的尤为重要。此次试验试图从土壤中分离出产淀粉酶的细菌，通过紫外线诱变育种等条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株。以达到加深对菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。 材料和方法 材料 1.1.1 来源：南师大北区教学楼附近的土壤。 1.1..2培养基：淀粉培养基的配制①固体培养基膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。②液体培养基：牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂 20g/L，pH7.0～7.2。优化条件培养基配制：①淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 4.0 。②淀粉3g/L，蛋白胨 10g/L， K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g， pH 7.2 。碳源培养基：①淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g， MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。②葡萄糖3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。氮源培养基: ①硝酸钠10g，淀粉3g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2②硫酸铵 10g，淀粉3g ，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，去离子水 1000mL pH 7.2。 1.1.3 仪器设备：全自动高压蒸汽灭菌釜，手提式高压蒸汽灭菌釜，电子台秤，普通天平 产淀粉酶细菌的分离筛选 1.2.1 制备土壤稀释液：称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。然后在离心管中依次稀释至10－3、10－4 稀释度。 制备淀粉培养基平板，制5块淀粉培养基平板，倒入融化好的淀粉培养基（温度为不烫手为宜）并轻轻摇晃混匀，置于桌面冷却为平板。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 1.2.2吸取稀释液：无菌操作法分别吸取10－3、10－4 土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的2块淀粉平板培养基上。 1.2.3涂板：用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置5min 划线分离：将10－1 土壤稀释液用接种环挑取一环，在一块淀粉培养基上进行划线分离。然后倒置于恒温箱培养。看演示 培养：倒置于房间30℃恒温箱培养24小时。 1.2.4筛选：24小时后，在之前稀释涂布和划线的3块淀粉培养基上选取典型细菌菌落（尽量选取边缘整齐和规则的菌落），并用记号笔进行编号。3块淀粉培养基上，观察是否有水解圈的产生，并测量其半径。对照备用点种平板和编号菌落的水解圈大小，挑取水解圈最大的一个菌斑，用记号笔将其勾选出来。 1.2.5 分离：将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的1块淀粉培养基平板上分别点种。将点种平板继续置于30℃培养箱中培养。 产淀粉酶菌在不同培养条件下的生长状况 1.3.1 发酵液接种：提前24h将平板菌种用接种环挑取，在液体试管中打散混匀，然后按1％接种量分别转接①pH4 ②pH7.2 ③碳源淀粉 ④碳源葡萄糖 ⑤氮源硝酸钠 ⑥氮源硫酸铵 六种液体摇瓶发酵培养基。 1.3.2 菌种保藏：挑取平板菌落，在斜面试管培养基上划线，30℃培养，然后置冰箱低温保藏。 1.3.3 菌体生长量的测定：将培养24h后液体摇瓶培养物分别取出2mL于试管中，加入8mL蒸馏水，进行5倍稀释。将各稀释液分别倒入比色杯中，在721型分光光度计600nm波长下测定吸光值(optical density，OD600值)。如果菌液浓度过大，可继续稀释后再进行测量，保证OD值应控制在0.1-1之间。分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价对菌体生长量的影响。 1.3.4 不同条件对淀粉酶活性