一株鸡源性乳酸杆菌的分离鉴定及特性研究(饲料研究) - 副本..docxVIP

一株鸡源性乳酸杆菌的分离鉴定及特性研究张飞燕1张根伟1张丽萍11河北省科学院生物研究所石家庄 050081摘要：文章旨在筛选用于研制益生菌制剂的优良乳酸菌菌株。笔者从嶂石岩山区散养鸡的鸡粪中，经初筛、复筛分离到 1 株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有强颉颃作用的产酸菌，编号为R-8，经形态及生理生化试验初步判定为乳酸杆菌，再结合16SrDNA分子鉴定，进一步确定为植物乳杆菌。该菌株可以利用葡萄糖、乳糖、蔗糖等多种碳源，平板扩散抑菌试验结果得出，对大肠杆菌的抑菌圈直径达16.0mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达16. 5 mm，且在PH为2.0时，存活率达到86.4%，在胆盐浓度3%时，存活率为 53.7%，具有用于研制益生菌制剂的潜力。关键词：益生菌，分离鉴定，16S rDNA益生菌制剂是近年来国内外迅速崛起的饲料添加剂，其作用可以维持肠道内菌群平衡、促进动物生长和提高机体免疫力等，还能够解决饲用抗生素产生的耐药性，药物残留等问题，已被广泛应用于畜牧和饲料领域。益生菌制剂的制备需要益生菌，而产乳酸的乳酸杆菌因能维持鸡肠道微生物区系平衡和消化机能，抑制腐败菌，改善肝功能，安全、优质、高效等优点成为最理想的益生菌之一。本文从鸡粪便中分离筛选鉴定出了1株颉颃性强的植物乳杆菌，并对其生理生化特性及耐受特性进行了研究，以期为乳酸杆菌益生菌制剂将来的开发和应用奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌两种病原指示菌均由河北省科学院生物研究所提供。1.1.2培养基MRS培养基：蛋白胨10g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，碳酸钙20 g/L，牛肉膏10 g/L，乙酸钠5 g/L，硫酸镁0.02 g/L，吐温80 1ml，酵母膏5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，硫酸锰0.05 g/L。PH6.8-7.0。1.2方法1.2.1菌株的分离取从山区采集回的散养鸡的鸡粪10g，用水浴锅水浴，条件为80℃，30min。采用倾注法按10倍稀释法制成不同浓度的鸡粪稀释液，取3个合适的稀释浓度分别吸取100ul加入无菌平皿中，做3个平行，将先前融化并冷却至50℃左右的MRS培养基，向每个平皿中倾倒约10ml，迅速使其混合均匀，凝固后37℃倒置培养48h。挑取有溶钙圈（产酸）的菌落，“Z”形反复划线分离至纯菌株。1.2.2对峙培养法初筛取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌这两种病原指示菌分别涂布于MRS培养基平板上，将前期分离保存的产酸菌，穿刺到此两种MRS培养基平板上，37 ℃进行对峙培养24 h，测定抑菌圈的大小。1.2.3平板扩散法复筛将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌两种病原指示菌分别接种到普通肉汤培养基，37℃培养18h，配制成106cfu/ml的菌液作为指示菌液。将初筛试验中抑菌效果明显的菌株置于盛有MRS液体培养基的厌氧管中，37℃、48h培养3代，将第3代液体培养物离心取上清，过滤除菌，继而用直径为1cm的打孔器在表面涂有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MRS培养基平皿上等距离打三个孔，每孔点样100 μL，同时设用0. 2 mol/L NaOH 调节发酵液为p H6. 5 抑菌试验对照，37 ℃恒温培养24 h 后，测量抑菌圈直径。1.2.4形态及生理和生化鉴定对复筛菌株进行显微镜观察，并参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对复筛的菌株进行生理生化鉴定。1.2.5对酸的耐受试验取复筛菌株发酵24 h 的菌液10 m L，3000 r /min 离心15 min，倒掉上清，用生理盐水将离心后的菌体洗3次，再将复筛菌株的菌悬液用10 mol /L 的Hcl调至pH 值分别为2.0、3.0和4.0，最后用生理盐水定容至 10 m L，放在 37 ℃培养箱恒温处理 2 h。将2h后的菌悬液，做稀释平皿活菌计数，从而计算出菌株的存活率，以 pH 5.5 ～6.5的菌液为空白对照。存活率=待测PH的菌液活菌数/p H5.5～6.0的菌液活菌数×100% 。1.2.6对胆盐的耐受试验菌液按5% ( v / v) 的量接种于胆盐浓度为0.1% 、0.2% 、0.3% 、0.4% ( w / v) 的 MRS 培养基中，以不加胆盐的 MRS 培养基为对照，37 ℃培养30 min，取样进行平板菌落计数，计算乳酸菌存活率。1.2.716S r RNA 基因序列分析和系统发育树构造（1）PCR产物测序扩增 16S r RNA 序列的上行引物为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 下行引物为：5′- ACGGCTACCTTGTTACGACT - 3′。对菌株R-8进行 16S r DNA 的 PCR 扩增。将得到的PCR 产物送北京生工生物技术有限公司进行测序。在 Gen Bank 数据库中进行相似序列比对,