溶菌酶高产菌株的筛选.pptVIP

溶菌酶高产菌株 * * 筛选及其产酶研究 1、溶菌酶的分布 目前已知溶菌酶在自然界中分布极为广泛， 已经发现高等动植物组织及分泌物、原生动物、 昆虫和各种微生物中都有溶菌酶存在 如鸡卵清中含有相当量的溶菌酶（约3.4％至3.5％），此外，人体、蜜蜂、蚜虫等均发现有溶菌酶 动物溶菌酶 植物溶菌酶 微生物溶菌酶 植物中的溶菌酶通常比动物来源的溶菌酶具有较大的分子量 溶菌酶 人们从上世纪６０年代发现微生物也产生溶菌酶，并且进展很快。溶菌酶可以用溶菌谱来作 为酶专一性的主要指标，但由于这类酶的作用机制十分复杂，所以这种分类并不能反映酶的作用 本质，现在以酶的作用性质来进行分类。 一般把微生物产生的溶菌酶分为７类 ①内．Ｎ．乙酰已糖胺酶 ②酰胺酶 ③内肽酶（Peptidasc）和蛋白酶 ④β-1，3.β-1，6葡聚糖酶和甘露糖酶（葡甘露糖酶） ⑤磷酸甘露糖酶 ⑥壳多糖酶 ⑦脱乙酰壳多糖酶 2、溶菌酶菌株的筛选 由于溶菌酶微生物的分布广泛性，所以本课题从土壤微生物入手，从中筛选分离出溶菌酶高产菌株，并进行培养保存 其中的土壤样品是来自17个省市地区的各种植被类型土壤样品156份 主要培养基 (l)指示菌培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%， pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。 (2)初筛培养基及菌株的保存培养基: 蛋白胨1%，牛肉 膏0.5%，NaCl 1%，琼脂 1.5%-2%。 pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。 (3)基础培养基: 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 1%。 pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。 (4)摇瓶发酵产酶培养基:可溶性淀粉 1.25%，牛肉 膏2.5%，玉米浆1%，Tween 0.1%， pH值调至7.0，121℃灭菌 20min。 产酶菌株的分离 采用双层平板法 以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用混菌方法制成下层培养基 将土壤样品充分研磨，梯度稀释后，取 1mL土壤悬液加入已经凝固的下层培养基上，再倒入50℃营养琼脂培养基，混匀，制成上层培养基 28℃培养，每天观察并记录 下层： 上层： 又叫双层琼脂平板法 　　先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。 用灭菌牙签挑取在初筛双层平板上产生透明圈的菌落，进行划线分离 挑取单一菌落，点接到含金黄色葡萄球菌的验证板上，37℃培养2d。观察其是否再次产生透明圈，以及产圈稳定性。 将经过验证仍产透明圈的菌株进行纯化并保存。 高抑菌活性菌株的初步筛选 将分离得到的具有抑菌活性的菌株进行摇瓶发酵，利用营养肉汤培养基， 300mL三角瓶装瓶量 50mL，接种量2%，37℃， 200rpm摇振培养。每8h取发酵液，在含金黄色葡萄球菌的营养琼脂平板上用直径6mm无菌中空管打孔，注入50uL发酵液。37℃温育24h。观察结果并用游标卡尺测量透明圈直径。筛选抑菌圈较大的菌株。 抑菌活性成分的初步鉴定 将筛选到的具有较强抑菌活性菌株进行摇瓶发酵，取36h发酵液 12000rpm、 20min离心。 取上清液进行蛋白酶K处理，20uL蛋白酶K(20mg/mL)加入500ul上清液中，50℃反应1 h，各取50匹在含有金黄色葡萄球菌的营养琼脂板上打孔点样，37℃培养24h观察透明圈。 将发酵液离心取上清进行透析浓缩，发酵液 10mL加入透析袋(透过规格8一 14.0KD)中，扎紧，置于聚乙二醇20000中，4℃透析过夜。测定透析前后酶活力。 溶菌酶高产菌株的复筛 对初步鉴定抑菌活性成分是蛋白质的高活力菌株进行摇瓶发酵试验，测定溶菌酶活力，根据产酶活力，结合菌株特性，综合确定筛选菌株。 *