nm23-H1基因转染L9981肺癌细胞前后基因表达谱变化.docVIP

nm23-H1基因转染L9981肺癌细胞前后基因表达谱变化 　　摘 要：应用基因芯片检测L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞基因表达谱的改变。提取L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞的总RNA，纯化为mRNA后再转录为cDNA。cDNA经限制性内切酶Sau3AI消化后，cDNA片段分别用cy3和cy5标记， 与定制的包含14000个基因芯片杂交。杂交结果经扫描和软件分析，nm23-H1基因转染L9981细胞后发现1156(8．26％，1156/14 000)个基因表达上调，而642(4．59％，642／14000)个基因表达下调。涉及基因包括信号传导、癌基因与抑癌基因、转移相关基因、细胞周期与凋亡、细胞外基质与细胞骨架相关基因， 以及细胞因子和转录因子等。nm23-H1基因是通过对转移相关基因的调节来发挥其抑制肺癌细胞株L9981侵袭和转移作用的。 　　关键词：L9981；基因芯片；基因表达；nm23-H1基因 　　中图分类号：R734．2；Q813．1 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2006)01―0077―05 　　nm23-H1基因已被证明是肿瘤转移抑制基因。 将nm23-H1基因的cDNA转入nm23-H1基因表 达缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981，可 以逆转其恶性表型。但是nm23-H1抑制肺癌侵 袭与转移的分子机制尚不十分清楚，我们以往的 研究表明，nm23-H1基因抑制肿瘤侵袭与转移可 能是通过对转移相关基因的调控实现的，为进 一步研究nm23-H1作用的分子机制，我们应用基 因芯片检测了nm23-Hl转染L9981前后相关基因 表达的变化。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1．1 材料 　　l，1．1 细胞株 　　1)L9981(高转移大细胞肺癌细胞株)；2) L9981－nm23-H1(稳定表达nm23-H1基因的 L9981细胞株)。均由四川大学华西医院四川省 肺癌分子重点实验室提供。 　　 　　1．1．2 常用试剂及设备 　　精制小牛血清和RPMI t640培养基购自Hy－ clone公司；用120mmol／L的NaOH溶液配成l mmol／L的贮备液，4℃贮存。SuperScriptTM II RNase H- Reverse Transcriptase(1nvitrogen Cat．No．18064-014)，dATP、dGTP、dCTP、 dTYPOligod(T) Primer(Bioasia合成)，Cy5 (Amersham，Cat，No．PA55021)，Cy3(Amersham， Cat．No．PA53021)， RNA inhibito(Takara， Cat．No．D2311A)，OlAquick Nucleotide Removal Kit(OIAGEN，Cat，No．28306)Genemachine：型号 OmniGrid 100Pixsys5500芯片打印仅购自Carte― sian公司，ScanArrayLite芯片扫描仪??其分析软 件Quantarray购自GsiLumonics公司，玻片及芯 片杂交盒购自Coming公司。 　　 　　1．1．3 基因芯片 　　项目所用芯片版本号为2．2人cDNA基因表 达谱芯片，产品目录号为SBC-R-HC-100-22．芯片 编号为17874，17873(上海生物芯片工程公司)。 　　 　　1．2 方法 　　1．2．1 总RNA的纯化 　　(RNeasy　Mini Kit)应用QIAGEN RNeasy Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protoc01。 　　 　　1，2，2 总RNA质量检测 　　(Labonchip检测)具体操作步骤参考人cD- NA表达谱芯片使用手册，SBC-H―HC-100-22，具 体结果见《样品质检报告》。Lab-on-chip参照Agi- lent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，按照软件 提示进行RNA电泳操作，评价RNA质量。 　　 　　1．2．3 样品制备 　　cDNA用Sau3Al酶切后接上接头，之后用 PCR通用引物扩增。PCR产物经PCR产物纯化 试剂盒纯化后取出500 ng。实验标记方法采用 cDNA直接标记法，其中实验组RNA (L9981－nm23-H1)采用cy3荧光标记，对照组 RNA(L9981)RNA采用荧光cy5标记。加入Cy3／ Cy5标记的引物(100 lLm01／L)21lL(NaOH作用 的对照组用Cy5标记，As20，作用的处理组用Cy3 标记)，同样条件再行PCR扩增和纯化，将PCR产 物终浓度调至200mg／L。