曲古抑菌素A对结肠癌细胞株SW480细胞周期影响机制研究.docVIP

曲古抑菌素A对结肠癌细胞株SW480细胞周期影响机制研究 　　摘 要：为了研究组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对结肠癌细胞周期和凋亡的影响，初步探讨TSA作用细胞周期的可能机制，将人结肠癌细胞系SW480经TSA处理后，运用流式细胞术检测细胞周期、凋亡以及细胞周期素的变化，最后采用western-blot对细胞周期相关的基因进行检测。结果表明，TSA处理细胞后，TSA能够延缓细胞周期G1-S进程，阻滞细胞于G1期，并且影响细胞周期素cycliE、cyclinA聚集，而对凋亡无明显的影响。Westem-blot显示，TSA能够上调p21Wafl/Cipl、p27Kipl的表达，下调CDK2、cyclinE以及cycli-nA的表达。以上结果说明在结肠癌细胞中，TSA能够通过上调p21Waftl/Cipl、p27Kipl的表达以及下调CDK2、cy-clinE、cyclinA的表达，从而阻滞细胞周期于G1期，最终影响肿瘤细胞的生长，以上研究为HDAC抑制剂应用于结肠癌治疗提供了理论依据。 　　关键词：结肠癌；曲古抑菌素A(TSA)；细胞周期 　　中图分类号：Q786；R735．3+5 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2006)01-0039-06 　　真核细胞中，遗传信息贮藏在高度保守的染 色质中，染色质的基本结构单位是核小体，核小体 是由146 bp的DNA包绕着核心组蛋白构成的， 核心组蛋白包括：H2A、H2B、H3、H4.核心组蛋白 在进化中是高度保守的，而可被翻译后修饰的主 要是核小体外的N端的氨基酸尾巴。组蛋白末 端能被各种不同的翻译后修饰，包括：乙酰化、甲 基化、磷酸化。其中乙酰化、泛素化修饰赖氨酸； 磷酸化修饰苏氨酸、丝氨酸；甲基化既能修饰精氨 酸又能修饰赖氨酸。 　　现在研究得比较清楚的翻译后修饰是乙酰化 修饰对细胞生物学的影响，通常情况下，HDAC (组蛋白去乙酰化酶)和HATs(组蛋白乙酰化酶) 调节着赖氨酸和精氨酸的乙酰化状态，以保持基 因的活性或失活状况，组蛋白乙酰化与基因活化 以及DNA复制相关，组蛋白的去乙酰化和基因的 失活相关。乙酰化转移酶(HATs)主要是在组蛋 白H3、H4的N端尾上的赖氨酸加上乙酰基，去乙 酰化酶(HDACs)则相反，不同位置的修饰均需要 特定的酶来完成。乙酰化酶家族可作为辅激活 因子调控转录，调节细胞周期，参与DNA损伤修 复，还可作为DNA结合蛋白。去乙酰???酶家 族则和染色体易位、转录调控、基因沉默、细胞周 期、细胞分化和增殖以及细胞凋亡相关。 　　结肠癌是多基因、多步骤的致癌过程，包括癌 基因的激活和(或)抑癌基因的失活等。而在基因 的表达调控中，表观遗传修饰有着重要的作用， 主要包括DNA甲基化修饰和组蛋白乙酰化修饰。 曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)是去乙酰化酶 (HDAC)抑制剂。HDAC抑制剂可以通过抑制组 蛋白去乙酰基酶(HDACs)，阻断由于HDAC募 集功能紊乱而导致的基因表达受抑，从而达到 抗肿瘤效应，本研究通过TSA体外作用于结肠 癌细胞SW480，对处理作用前后细胞的细胞周 期、细胞周期素以及相关的蛋白表达进行观察 与研究，从而探讨TSA的作用机制，为将更为有 效的HDAC抑制剂应用于结肠癌治疗提供理论 依据。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1．1 主要试剂 　　TSA溶于DMSO(二甲基亚砜)中，浓度为(1 g／L)置于-20℃冰箱。TSA及DMSO均购自Sigma 公司(由晶美生物工程有限公司代理)，RPMll640 购自GIBCO公司，小牛血清购自杭州四季清公 司，MIT购自宝泰克公司。一抗p53、p21、p27、 CDK2、cyclinE、cyclinA、a-tublin购自SantaCruz， anti-AcetylatedH3购自Upstate。 　　 　　1.2 细胞株及细胞培养 　　SW480细胞系购自中南大学分析测试中心 细胞生物室。采用10％小牛血清的RPMll640 培养液(含有1 x105U／L)青霉素和100mg／L 链霉素)，在37t、5％的C02孵箱中培养．取对 数生长期细胞进行实验。 　　 　　1．3 细胞周期分析 　　收集TSA作用8h后的细胞，用70％的预冷 乙醇固定24h 以上，加1 mLPC缓冲液和100 mg／LRNase(Sigma公司)50μL后，再加人50 mg／L碘化丙锭(Sigma公司)5001tL，4℃室温避 光30min，而后用流式细胞仪(FACSsort，Becton Dickinson)分析细胞周期。 　　 　　1.4 WesternBlot 　　用3去污试剂提取总蛋白质，用