热敷散对兔膝骨性关节炎血清中mmp-2和mmp-3的影响-effects of hot compress powder on mmp - 2 and mmp - 3 in serum of rabbits with knee osteoarthritis.docx

引 言 骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是膝关节炎症中最常见的病因。膝骨性关节 炎在老年人群中最为常见，男女均可发病。由于人群预期寿命的延长，在 20 世纪内骨 性关节炎的发病率明显增高，尤其是在肥胖的老年人群。大于 60 岁人群中 50%以上有 骨性关节炎的 x 线片表现。骨性关节炎是老年人关节疼痛和致残的主要原因。据世界 卫生组织(WHO)统计，骨性关节炎在女性患病率中占第四位，在男性患病率中占第八位， 我国 60 岁以上者膝骨性关节炎发病高达 49%。[1]经过多年的研究，人们发现 OA 的发生 与年龄、外伤、内分泌、软骨代谢、免疫异常等有关。最近研究表明，基质金属蛋白 酶(MMP),是基质金属蛋白酶超家族的成员之一。基质金属蛋白酶(MMP)是今年来发现的 一类能够降解细胞外基质的蛋白酶,存在于正常人体,参与软骨基质的降解,骨吸收,金 属蛋白酶不仅可以直接降解Ⅱ,Ⅸ,Ⅺ型胶原,还可以调节自身 MMPS 活性,在 OA 病人中 有显著性增高。[2]研究表明，基质金属蛋白酶(MMP)在 OA 发病机制中起着重要的作用， 在 OA 患者和模型动物体内基质金属蛋白酶(MMP)增加，血清含量增加的基质金属蛋白 酶(MMP)可破坏关节软骨，引起临床症状；降低血清中基质金属蛋白酶(MMP)含量，可 减轻软骨损伤，延缓疾病的发展。而刘老师在多年的工作中应用药物热敷散治疗患者 早期 OA 取得了很好的疗效，因此此次研究选用热敷散治疗药物，研究对兔膝骨性关节 炎模型用药后血清中 MMP-2 和 MMP-3 含量变化，从而明确热敷散对膝骨性关节炎疗效 及其作用机理。 实验研究 1. 实验材料 1.1 实验动物 健康日本大耳白兔 40 只，体重(2.50±0.10)kg，雌雄不限，由动物实验中心提 供。各组大白兔实验前在动物饲养室喂养 1 周，室温下饲养进食、饮水。 1.2 实验仪器 天平；粉碎机；电热恒温水浴箱；光学显微镜；酶标仪。 1.3 实验试剂 木瓜蛋白酶；兔基质金属蛋白酶 2(MMP-2)定量检测试剂盒(ELISA)；兔基质金属 蛋白酶 3(MMP-3)定量检测试剂盒(ELISA)。 1.4 药品 中药热敷散花椒、大黄、川乌、白附子、干姜各 15g, 川断、独活、刘寄奴、秦艽各 20g，黄丹、伸筋草 、牛膝、艾叶、当归各 20g，冰片 3g,西药扶他林乳剂：3%戊巴 比妥钠；生理盐水等。 2．实验方法 2.1 动物分组 各组兔均在相同条件下，自由饮水、摄食。按照随机数字表原则，将 40 只日本 大耳白兔随机分为 4 组，A 组（正常对照组）、B 组（模型对照组）、C 组（热敷散组）、 D 组（扶他林乳剂组），每组 10 只。 2.2 造模方法 按日本头康彦[3]等的兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶，造成骨关节病变模型方法。正 常饲养 1 周后将 B、C、D 组兔用戊巴比妥钠(30mg/Kg 静脉注射)，麻醉生效后右腿膝关 节周围剃毛，然后用碘伏消毒皮肤，经关节正中进针将 1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液 0.5ml 注入兔膝关节腔，分别于实验的第 l、4、7 日注入兔膝关节中。 2.3 给药方法 于末次注入木瓜蛋白酶 2 天后开始给动物膝关节局部给药，每日 2 次，共计 4 周。 药量为成人的 1/6，均以右腿膝关节为热敷部位，具体如下： A 组、B 组：每日每只均以热毛巾包裹热敷 2 次，每次 30 分钟。 2 C 组：热敷散颗粒拌醋蒸热后局部包裹热敷 2 次，每次 30 分钟。 D 组：扶他林乳剂外擦后，热毛巾包裹热敷 2 次，每次 30 分钟。 2.4 取材方法 40 只兔在相同条件下正常饲养，分别给药 4 周后，腹腔注射 2%戊巴比妥钠 3Omg/Kg 麻醉后，置于兔架台上，固定四肢及头部，胸前区剃毛，用 5Oml 注射器心脏采血，置 于干燥不抗凝玻璃管中， 离心采血清，分装于 0.5ml 的离心管内，-20℃冰箱保存待 测。 3．检测指标 3.1 基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的测定 采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法 (ELISA)。其基本原理是: 将标准品、待测样本加入到预先包被兔基质金属蛋白酶 2(MMP-2)单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分， 再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物 A、B， 底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色， 颜色的深浅与样品中兔基质金属蛋白酶 2(MMP-2)浓度呈正相关，450nm 波长下测定OD 值，根据标准品和样品的 OD 值，计算样本中兔基质金属蛋白酶 2(MMP-2)含量。 3.2 基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的测定 采用双抗体两步夹心酶联免疫吸