软腐欧氏杆菌的ⅲ型分泌系统对梨火疫欧文氏杆菌harpin蛋白的识别与分泌-identification and secretion of erwinia piricola harp in the type ⅲ secretion system of erwinia humicola.docxVIP

摘 要 本文研究软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora) 分泌致病蛋白的 III 型分泌系统的组分是 否能识别梨火疫欧氏杆菌(Erwinia amylovora)存在于 mRNA 上的分泌识别信号 用 PCR 的 方法 将带有上游 75bp 可以在其 mRNA 的 5 端形成一个典型的作为 III 型分泌识别信号 的茎环结构的梨火疫欧氏杆菌的诱导植物过敏反应的 harpin 的基因 hrpN 从带有 hrp 基 因簇的质粒 pCPP430 上克隆到 pGEM-T 载体上 获得重组质粒 pWGF1 经化学法转化 到 hrpN 基因的转座突变体 DH5?(pCPP430hrpN )中 同时将 pWGF1 电击转化到胡萝卜 软腐欧氏杆菌 Se9R 中 转化子的无细胞抽提物CFEP 经 Western-blot 检测到 harpin 蛋白已被表达 带有双重质粒的 DH5?(pCPP430hrpN /pWGF1)在番茄植物上可以引起过 敏反应 Se9RpWGF1在大白菜上和马铃薯上的致病力明显低于 Se9R 初步表明一 种植物病菌的 harpin 蛋白可被另外一种病菌的 III 型分泌系统所识别 分泌并保持生物活 性 i 4 4 Abstract Bacterial pathogens of both animals and plants use type III secretion machines to secret virulence proteins. The signal that leads to the type III secretion is encoded as stem loop structure in the messenger RNA. Harpin, produced by Erwinia amylovora is secreted via type III secretion machinery. Erwinia carotovora Se9R and Erwinia amylovora belong to the same genus and they use type III secretion machines to secret virulence proteins. We used PCR to amplify hrpN coding region with 75bp upstream segment from pCPP430 which harbors hrpN gene cluster, and cloned it to pGEM-T vector to get pWGF1, which was then chemically transformed into DH5?(pCPP430hrpN ) and electroporated into Se9R. DH5??(pCPP430hrpN /pWGF1) induced hypersensitive response on tomato leaf and Se9R(pWGF1) showed significantly reduced virulence than Se9R on Chinese cabbage leaf and potato tube. Western-blotting analysis of the CFEP of Se9R (pWGF1) showed production of harpin protein. These results suggest the type III secretion machine in Se9R can recognize secretion signal in the gene of harpin in Erwinia amylovora and secret it as a biologically native form. PAGE PAGE 10 第一章 文献综述 生物界的所有细胞包括真核生物 原核生物中的细菌和古菌都可以产生与 细胞膜发生互作的蛋白 或者成为细胞膜的组成成分 或者被分泌到胞外 实 现其生物学功能 大多数胞外蛋白质都有 1 个 2 0 3 0 个氨基酸残基组成的信号肽并且经过 一般分泌途径 (GSP)而跨过细胞膜 [1] 其中对革兰氏阴性菌尤其是大肠埃希氏 菌的一般分泌途径研究最为深入 ,这类细菌所围绕的外膜结构特殊 ,两层膜间有 一层很薄的肽聚糖层和一个被称为周浆间隙周质的夹层空间 革兰氏阴性 菌的一般分泌途径将蛋白质转运到周浆间隙 ,同时还需要其它的机制使之跨越外 膜 而革兰氏阳性菌无外膜 一般分泌途径就是蛋白