973计划2017年立项项目申请书.docVIP

97?3计划201?7年立项项目申请书 1?．对非天然氨基酸具有特异性的氨酰tr?na?合成酶的高通量筛选首先，修改大肠杆菌或酵母细胞内的遗传密码，使无义的ua?g密码对应于感兴趣的非天然氨基酸。然后，筛选对非天然氨基酸具有特异性的氨酰-tr?na?合成酶，技术路线如下： ①在目标细胞中引入一个外源的氨酰-t?rn?a合成酶和trn?ac?ua?，使其保持活性且不与内源的氨酰-tr?na?合成酶和tr?na?反应（生物正交性）。 ②?改变编码氨酰-t?rn?a合成酶活性氨基酸的dn?a序列，建立氨酰-t?rn?a合成酶基因突变库。 ③?对氨酰-tr?na?合成酶突变库进行如图1所示的正负循环筛选，得到特异识别目标非天然氨基酸的合成酶变异体，使其只催化tr?na?cu?a与非天然氨基酸间的氨酰化反应。 2?．蛋白质翻译起始复合物结构解析首先我们将运用动态光散射仪，对获得的蛋白质和稳定蛋白质复合物样品的溶液状态进行分析，考察其是否处于均一状态，在不同条件（温度、浓度、ph等）下的稳定形态和凝聚状态；同时运用溶液光谱（包括cd?光谱和荧光光谱）方法分析蛋白质在溶液中的构象变化，综合各种因素初步确定适合于结晶实验的条件。然后摸索晶体生长的条件，尝试大量不同的沉淀剂、蛋白质浓度、ph和缓冲体系、以及不同添加剂等，得到高衍射质量的晶体用于x-?射线衍射分析。一旦获得蛋白晶体，将利用x-射线衍射