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Mol Cell：这个抗癌药物这么有潜力，为什 么你一直找不到它的真正靶点？试一试化 学遗传筛选 原创2017-10-16 订阅号APExBIO 与表型筛选配对的化学文库现在可以用来轻松鉴别具有治疗潜力的化合物。然而， 开发这些化合物的主要限制是确定其靶标。来自加利福尼亚大学细胞与分子药理学 系的Jost 等人使用CRISPRi / a 介导的化学遗传筛选来鉴定一个靶点仍然存在争议 的抗癌药物—rigosertib 的靶点，结果发现rigosertib 是微管（microtubule）稳 定剂，其靶点是微管。体外验证显示rigosertib 确实直接结合并破坏微管的稳定性。 此外，在与rigosertib 结合的界面中具有结构引导突变的微管蛋白（tubulin）对 rigosertib 产生了抗性，并确定 rigosertib 通过去稳定微管来杀死癌细胞。这些 结果证实了化学遗传筛选策略在确定化学试剂的生理相关靶标方面的重要性。相关 结果发表于《Molecular Cell》。 用于抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa）基因表达的 CRISPR 筛选平台，可 以将基因组范围的过表达和敲除筛选结合在一起，以鉴定人类细胞中候选药物和 其它小分子的靶标。 确定候选药物的靶点一直是一个很大的挑战，rigosertib （Estybon，ON 01910.Na ） 的开发历程就是一个很好的例子。Rigosertib 是一个很有潜力的临床评估抗癌小 分子，但是其分子靶标和作用机制一直未确定。 图Rigosertib 结构式 Rigosertib 最初被鉴定为polo-like kinase 1 （PLK1）的抑制剂，但是rigosertib 和良好表征的 PLK1 抑制剂 BI2536 引起的细胞表型有明显的差异。也有研究显 示，rigosertib 抑制磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）的信号传导，但目前尚不清楚这 种作用是否直接抑制PI3K。有研究基于显微镜的筛选将rigosertib 鉴定为微管去 稳定剂，但是，体外测定产生了相互矛盾的结果。后来，有人提出了 rigosertib 作为RAS 模拟物抑制RAS 信号传导，但是随后又被认为是间接通过JNK 介导的 SOS1，B-Raf，和C-Raf 的失活影响RAS 信号。因此，尽管在早期临床试验中 有十年的研究并具有良好的功效及耐受性，但是rigosertib 的分子靶标仍然不清 楚，严重阻碍了其在临床方面的发展。 在这里，作者提出了一个化学遗传策略，结合CRISPRi 和CRISPRa 筛选来确定 rigosertib 的靶标。任何化学遗传方法都面临一个挑战，那就是许多基因的表达调 控可以通过间接作用来影响对药物的敏感性（例如通过减缓细胞生长），阻碍直 接靶标的鉴定。而综合的CRISPRi / a 方法克服了这一挑战，提供了一种过滤器， 去除通过这种间接机制影响药物敏感性的基因，从而能够鉴定蛋白质水平直接决 定药物敏感性的基因。 首先，作者利用CRISPRi / CRISPRa 功能基因组学平台来筛选其沉默或过表达 影响对rigosertib 敏感性的基因。简言之，作者用第一代基因组规模CRISPRi 和 CRISPRa sgRNA （单导向RNA ）文库（靶向 15,977 个基因）感染了表达 dCas9-KRAB （CRISPRi ）、与SunTag 融合的dCas9 （SunCas9 ）、与VP64 融合的SunTag 结合单链抗体（CRISPRa）的慢性骨髓性白血病细胞（K562）。 作者比较了所有基因的CRISPRi 和CRISPRa 表型，推测rigosertib 的直接靶标 基因可能具有强烈相反的表型。在这个比较中，两个基因突出：KIF2C 和TACC3 。 KIF2C 的过表达使细胞敏感，相反TACC3 的沉默使细胞敏感。值得注意的是， 这两个基因参与调节微管（microtubule）动力学：KIF2C 编码微管解聚酶MCAK， TACC3 是直接或间接促进微管稳定性的微管结合蛋白，特别是在有丝分裂期间。 因此，微管去稳定的遗传操作使细胞对 rigosertib 敏感，而微管稳定会保护细胞 免受rigosertib 影响，表明微管的遗传去稳定增强了rigosertib 的细胞毒性。 图 敏感性筛选 接下来，为了验证