第三章 大肠杆菌基因工程-2.pptVIP

? Cleavage Sites Table for Fusion Proteins： Thrombin(凝血酶）Leu-Val-Pro-Arg▼Gly-Ser Enterokinase（肠激酶） Asp-Asp-Asp-Asp-Lys▼ TEV protease（Invitrogen)Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln▼Gly Factor Xa （X因子）Ile-Glu/Asp-Gly-Arg▼? PreScission（5℃切割！GE）Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln▼Gly-Pro Intein （内含肽，自切割，NEB）dithiothreitol cleavage ！ 常用多残基识别位点蛋白酶 Pinpoint Xa：Ile-Glu-Gly-Arg Pinpoint Xa tac 生物素结合肽编码序列 Xa因子识别位点编码序列 SP6 T7 Apr ori MCS ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC Xa-1 Ile Glu Gly Arg Glu ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C Xa-2 ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC Xa-3 NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI Xa因子切割位点 Strep.Tag(8)-streptavidin （Novagen） 1、表达诱导 2、未诱导 3、一次纯化结果 pMAL系统（NEB） 1、通过“tac”强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达 2、利用MBP对麦芽糖的亲和性，用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化 MBP-paramyosin表达与纯化的SDSParamyosin：副肌球蛋白 A: Lane 1:未诱导菌 Lane 2:诱 导表达菌B: Lane 1:过amylose柱，麦芽糖洗脱后的纯化蛋白, Lane 2:经Factor Xa切割后的纯化蛋白, Lane 3:经amylose柱二次洗脱后的paramyosin片段 PreSicission Protease Tag(5℃消化，GE） IMPACT系统 （NEB） 内含肽（intein） 一段随功能蛋白一起表达，并在表达后可进行自剪接的多肽，它兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性，与内含子（RNA水平自剪切）的作用方式类似。 *Intein :酵母来源的蛋白质剪接元件，类似于基因组中 的内含子 Intron 在 RNA 的剪接中所起的重要作用， intein 在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N 端 裂解，可以释放出与之相连的目的蛋白。 *IMPACT：枯草杆菌的几丁质结合域（ 5KD ，用于亲和 纯化）和 intein 组成一个双效的 fusion tag ，再与克隆 到多克隆位点的目的基因融合表达。 *融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（ 4 度） 条件下用含 DTT ，或者巯基乙醇，或者半胱氨酸的溶液 洗脱，即可 将目的蛋白洗脱 基于蛋白质剪接元件Intein的 IMPACT 系统 IMPACT系统一步纯化具有生物活性的T4 DNA连接酶 Line 1 (Clone): 未诱导的细胞粗提物 Line 2 (Express): 诱导后的细胞粗提物，有融合蛋白表达 Line 3 (Purify): 诱导剪切，4°C过夜，洗脱出T4 DNA连接酶 (目的蛋白)。 ? 4、寡聚型异源蛋白的表达 以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白高效表达 在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以 稳定表达小分子短肽 在一定程度上改善表达量 目的产物回收困难 短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。 串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶 降解的能力大幅度提高 寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后 的短肽分子容易出现序列不均一性 寡聚型异源蛋白的表达 寡聚型目的蛋白表达系统的构建 P SD gene gene gene gene T1