第三篇 章 基因工程载体 基因克隆课件.ppt

第三章 基因工程载体;第一节 基因克隆技术概述;首先利物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合。将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。 这种方法也就是应用基因工程技术术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组太小，在像当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。 ;;三、重组体的构建; 第二节 质 粒 载 体  （ Plasmid Vector);;;;2、质粒的复制与遗传;严密型质粒（stringent plasmid) 严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止 松弛型质粒 (relaxed plasmid) 松弛型质粒通常是分子量较小，不具传递能力的质粒，它在宿主菌内通常可含10-200个拷贝，而且不受宿主菌蛋白合成的影响，当宿主菌蛋白质合成停止时，例如当宿主菌遇上有抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素存在时，质粒DNA的复制仍可继续进行，甚至可将数十个增至几千个。 ;接合型质粒又叫传递性质粒，接合型质粒可以从一个细胞自主地转移到原来不存在这种质粒的另一个细胞中去。接合型质粒的分子比较大，编码一套控制质粒DNA转移的基因。这一过程是由接合型质粒上的转移基因（tra genes）控制的。 非接合型质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自我转移。 ;所谓质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象 只有在确实证明第二种质粒B已经进入含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主细胞限制体系的降解作???，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的质粒 质粒不亲和的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 ;根据质粒上带有特殊用途的基因;;3、构建质粒克隆载体的基本策略 1）分子量尽可能小，多拷贝，而且便于提取和纯化。分子量越小越能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源性DNA就越长。分子量小的质粒往往属于松弛型质粒。 2）缺失tra基因，质粒就不会从一个细菌接触转移到另一个细菌，所以是非接合型质粒。 3）质粒序列中具有一个或多个单一的限制性内切酶位点。 4）具有一个或几个报告基因，而且引入的基因应在限制性内切酶的单切点之内，由于插入外源基因，这个报告基因灭活，从而便于筛选重组体。;4、质粒的改造 “天然质粒”:它一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColEI、RSF2124和pSC101 。 第一个用于基因克隆的是天然质粒pSC101，它对于EcoRI限制酶只有一个识别位点，而且在此克隆外源DNA既不会影响它的复制功能，也不会破坏其唯一的四环素抗性 选择记号（Tetr）。 ;三、常用的质粒载体 ;2、pBR322质粒载体的物理图谱;3、pBR322质粒载体的构建 ;;4、pBR322质粒载体的优点 ;（二）pUC质粒载体;2、pUC质粒载体的结构 ;3、pUC质粒载体的优点 ; （三）TA克隆载体 ;四、酵母中的质粒载体 ;质粒-2μm环; ;; pJDB 219;选用哪种类型的真菌质粒？; 第三节 其 它 载 体;一、噬菌体载体;2、噬菌体的结构及其核酸类型;T2噬菌体颗粒示意图;3、噬菌体的感染性（1）噬菌体的溶菌生命周期;（2）噬菌体的溶源周期;（ⅱ）溶源周期的主要特征; 部分噬菌体的性质 名称 核酸 分子质量 构型 宿主 T4 dsDNA 130×106 线形 E.coli，烈性 λ dsDNA 32×106 线形 E.coli，温和 P1