核酸物理化学性质基本要求.pptVIP

(二) 复性 T1/2 × C ＝ const DNA浓度与复性时间的关系 影响复性速度的因素 1.DNA的片段越大,复性的速度越慢; 2.DNA的浓度越高,复性的速度越快; 3.DNA的重复序列越多,复性的速度越快; 4.溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低; 5.适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。 DNA复性与Cot分析 当 C/C0=1/2时， k=1/C0t1/2 第14章 核酸的物理化学性质 基本要求 1.熟悉核酸的水解方法及水解产物。 2.掌握核酸的酸碱性质。（重点） 3.掌握核酸的紫外吸收。（重点） 4. 核酸变性、复性及杂交有关知识及应用（重点、难点） 一、核酸的水解 (一) 酸水解 糖苷键比磷酸酯键更易水解 特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解 (二) 碱水解 通常水解RNA，水解DNA较困难 (三) 酶水解 1）RNase水解嘧啶核苷酸3’-磷酸二酯键 2）释放核苷、2’，3’-环磷酸嘧啶核苷 3）2’，3’-环磷酸嘧啶核苷水解释放3’-磷酸核苷 核酸酶分类 底物专一性：RNA酶（RNase）、DNA酶（DNase） 作用方式：核酸内切酶、核酸外切酶 作用键：水解3’-磷酸酯键核酸酶 水解5’-磷酸酯键核酸酶 DNA与限制性内切酶 双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断, 又可以再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP——分子克隆和DNA重组技术的基础。 大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4～6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内发挥iu的是防御外来DNA入侵的国防军的作用。 二、核酸的酸碱性质 碱基 adenine 4.15, 9.8 cytosine 4.5, 12.2 guanine 3.2, 9.6 thymine 9.9, 13 核苷 adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8 cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3, 13 guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5 uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13 核苷酸 AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4 ADP 3.9, 6.3 : --------- CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6 GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP2.9,9.7 UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0 碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式。 碱基中的H原子一般不移动，因此很少有亚氨基团。 在中性pH条件下，参与氢键的-NH2基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定。 碱基、核苷、核苷酸的pK值 三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 ?g SS DNA 37 ?g RNA 40 ?g 四、核酸的变性，复性及杂交 （一）DNA分子的变性 变性和复性的含义 DNA的变性在紫外吸收上的变化 Tm的定义 影响Tm的因素 1.DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G+C)%， 或GC%=（Tm-69.3）×2.44 3.介质的离子强度较高时, Tm的值较大。 4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值。 5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。 SSC溶液，常用于DNA的溶解。 * *