氨基质子化.PPT

小结 利用溶液的PH 值与某具有质子转移能力的基团的pKa值，可以推导出一个通用公式来计算该基团的平均净电荷数（Z） 氨基基团所带的正电荷数Z=（+1）/(1+10(PH-pKa)) (注意：当PH＜＜pKa，Z约等于+1) 羧基基团所带的负电荷数Z=（-1）/ (1+10(pKa - PH)) (注意：当PH＜＜pKa，Z约等于0；当PH值低于pKa值2个单位以下，则认为基团已完全质子化) 例题：利用书上Asp的pKa值，当溶液的PH值为1.0，3.9和6.8时，求Asp分子的平均净电荷数？ 第三节 氨基酸和蛋白的分离方法 2、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（P31），这部分内容在实验课当中有具体的要求。 3、蛋白质的分离纯化方法 第四节 蛋白质测序 3、蛋白质测序的策略 3.1 判断有几条肽链 3.2 得到游离的肽链 3.3 把长的肽链断裂成短的肽链 3.4 测定短肽的氨基酸序列 3.5 推测出蛋白的序列 4、蛋白质测序的方法 4.1 末端分析法（判断肽链的条数） 1953年，Sanger测定出了第一个多肽的氨基酸序列（牛胰岛素） 他用2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）与N-末端的氨基酸残基进行反应，把肽链切开，在10年的时间里，他用了100克胰岛素来确定其氨基酸序列。在1958年获得了诺贝尔奖。 DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸） 4.3 可以用化学药品或酶的方法把长的多肽链切割成短的多肽链 CNBr溴化氰可以断开Met羧基端的肽键 胰蛋白酶可以断开Arg（精氨酸）和 Lys（赖氨酸）羧基端的肽键；胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）可以断开Phe（苯丙氨酸）, Tyr（酪氨酸）和 Trp（色氨酸）羧基端的肽键 用以上方法得到的短肽可以用色谱分析和电泳的方法进行分离，然后再测序 4.4 用埃德曼降解法确定短肽的氨基酸序列 苯异硫氰酸酯（phenylisothiocyanate, PITC）在弱碱性条件下，与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲（phenylthiohydantoin, PTH）衍生物，即PTH-氨基酸，此反应又称之Edman反应，该反应是蛋白质或多肽氨基酸序列测定常用的反应。 PTH-氨基酸可以用层析法进行确定。 1、一个氨基酸的a-羧基与另一个氨基酸的a-氨基缩合，形成的酰胺键，也称为肽键。 1.1氨基酸通过肽键连接形成的产物称为肽（peptide） 1.1.1 最简单的肽是由二个氨基酸残基形成的肽，称为二肽。由于肽中的氨基酸已经不是游离的氨基酸了，所以称为氨基酸残基。 1.1.2 由三个残基形成的肽称为三肽，依此类推。每形成一个肽键将丢失一分子水（要有能量提供，是吸能反应，不能自发的发生）。肽链中的氨基酸的a-氨基和a-羧基都用于形成肽键，所以一个肽链只有一个游离的a-氨基（常称为肽链N端）和一个游离的a-羧基（常称为肽链C端），共价修饰的末端和环形的肽链除外。高分子量的多肽一般都称为蛋白质。 1.1.3 这种缩合反应可以重复发生形成寡肽（50个aa以下），多肽（50~100个aa之间）和蛋白质（大量aa的聚合物） NH2 COOH 1 NH2 COOH 2 NH2 C N COOH O H 2 1 兩個氨基酸分子头尾连接起來 多肽键 的形成 脫水 Carbodiimide 单位小分子 N-C-C-N-C-C-N-C-C ?-碳为中心 N-C-C-N-C-C-N-C-C ? ? ? 兩端氨基酸 N-C-C-N-C-C-N-C-C 肽键的定位 N-C-C-N-C-C-N-C-C 如何确定一段 多肽 1.2 肽用氨基酸的数量表示，如八肽，并且肽的分子量可以测定 1.2.1 肽中每个氨基酸的平均分子量约为110. 1.2.2 如50肽，分子量大约5500. 1.2.3 绝大多数天然的多肽有50到2000个氨基酸残基，因此起分子量在5500到220000之间。 1.3很多短肽具有重要的生物学功能 2、 应用不同的化学反应鉴定氨基酸 2.1 氨基酸与茚三酮（ninhydrin）的反应是一个检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。 2.1.1 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物（l570）. 2.1.2 亚氨基酸Pro，则生成黄色化合物（l440） 2.1.3 在一定的反应条件下，产生的颜色的强度（溶液中的光吸收）与氨基酸浓度成比例，根据溶液的吸光度，可以算出相应的氨基酸和蛋白质的浓度。 2.2 二硫键的断裂 PTC adduct Shortened peptide 4.2 二硫键的断