致病性迟缓爱德华氏菌鉴定、pcr检测及esac基因功能鉴定.pdfVIP

致病性迟缓爱德华氏菌的鉴定、PER检测及esaC基因的功能鉴定 致病性迟缓爱德华氏菌的鉴定、PCR检测及esaC基因的功能 J土￡-—-【=鉴定 摘要 迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是一种革兰氏阴性肠道菌，感染宿主 范围广。由该菌引起的爱德华氏茵病是水产养殖最常见的传染病之一，给水产业 造成巨大的经济损失。本研究从发病大菱鲆分离和鉴定了2株迟缓爱德华氏菌， 建立了致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检测方法，对8$t1C基因的功能进行了鉴定， 构建了迟缓爱德华氏菌的三个基因缺失突变株并进行初步鉴定，为将来用于筛选 减毒活疫苗打下基础。主要结果如下： 一、迟缓爱德华氏菌的分离鉴定：从两个养鱼场的发病大菱鲆分离得到了2 株优势菌心和MHK2。人工感染大菱鲆实验表明Ⅲ和MHK2对鱼的半数致死浓度 rDNA序列分析表明， (LD50)分别为105．4c舢恤和105‘6C如／rIll。对斟和MⅧQ的16s 它们与迟缓爱德华氏菌的序列相似性为99％。APIID32E生理生化检测表明，它 们与标准迟缓爱德华氏菌的各项反应指标高度一致。因此将YN和MHK2鉴定为迟 缓爱德华氏菌。 1二、致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检测：以迟缓爱德华氏菌的主要毒力因子 设计特异性引物用于迟缓爱德华氏菌PCI湓测。结果表明，在11株致病性菌中都 检测到了esaV和katB基因的存在；在13株非致病性菌株中均没有检测到嘲瑾 因，有4株检测到勋啦基因。根据上述结果，esa躔因可以作为区分致病性和非 致病性迟缓爱德华氏菌的一个分子标记。 三、esac基因的功能鉴定：迟缓爱德华氏菌T3SS的1个装置蛋白。本研究 虽然可以正常的表达，但是不能分泌到细胞外，同时细菌的自凝聚现象消失。毒 力检测发现，突变株对蓝曼龙鱼的半数致死浓度(U)50)比野生型菌株提高了lO 倍。结果表明，啪c基因影响迟缓爱德华氏菌的毒力和T3SS相关蛋白的分泌。 本研究进一步确定了esaC基因作为迟缓爱德华氏菌T3SS装置蛋白的功能，加深 了对迟缓爱德华氏菌致病机理的了解。 致病性迟缓爱德华氏茵的鉴定、PCR检测及esaC基因的功能鉴定 四、三基因缺失突变株的构建和初步鉴定：利用基因缺失突变技术，构建了 成酶基因aroA的三基因缺失突变株。人工感染实验表明，该突变株的毒力大大下 降，LD50108cfu／ml。细菌在鱼体内存活实验表明，该突变株细菌在牙鲆鱼体内 的存活时间不超过18天，在21天可检测到牙鲆血清产生凝集抗体。结果表明，该 迟缓爱德华氏菌的三基因突变株作为减毒细菌，可用于下一步的减毒疫苗筛选和 鉴定工作。 关键词：迟缓爱德华氏菌细菌鉴定PCR检测基因缺失突变858锄能鉴定 减毒细菌 6 致病性迟缓爱德华氏菌的鉴定、PcR检测及esaC基因的功能鉴定 Cl i onof i c assi fi cati Detect on，PCR Pathogen tardaandFuncti I Characteri zati onof Edwardsie／la ona esaC gene Abstr act awidehost Edwardsiellatardaisa enteric thathas Gram-negative