热点实验：CHIP染色质免疫沉淀实验案例介绍.pdf

背景：真核生物的基因组 DNA 以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA 在染色质环境下的相互 作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的 EMSA 技术相比，染色质免疫沉淀技术 （CHIP）能真实完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白，是目前研究体内 DNA 与蛋白质相互 作用的最佳方法。 原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA 复合物，超声将其随机切断为一定长度范围 内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA 复合物，通过洗脱的方 法得到富集的靶蛋白-DNA 复合物，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段，通过对目的片断的 纯化与检测（PCR 分析），从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。 应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA 损伤与凋 亡分析。 步骤： 1）甲醛处理细胞 2）收集细胞，超声破碎 3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合 4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物，沉淀 5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合 6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物 7）解交联，纯化富集的DNA-片断 8）PCR 或基因芯片分析。 实验案例 证明 C/EBP 与 Tmub1 启动子或增强子序列的结合 实验背景：在 IL－6 诱导条件下,利用 CHiP 技术提取 C/EBP－DNA 复合物，以 Tmub1 基因的碱基 序列设计引物，以提取的 DNA 为底物，进行扩增，从而证明 C/EBP 结合的 DNA 含有 Tmub1 基因， 进一步确认 C/EBP 与 Tmub1 启动子或增强子序列的相互作用。 实验分组：分 2 个组进行实验普通 PCR 检测和 WB 检测（检测 Tmub1 蛋白表达水平，抗体嘉美生 物实验室提供。注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约 大量实验经费。） 第一组：A 组 第二组：B 组 转染 3 天后收集细胞做 CHIP-PCR 以及WB 检测 实验对照：设定的对照有 1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II） 2、INPUT 对照（DNA 片段在沉淀以前，收集下来的对照） 3、阴性对照（非免疫 IgG 血清吸附，Normal Mouse IgG） 细胞转染流程:略 EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371) 1、Kit Description：试剂盒内含的 RNA 聚合酶 II 阳性对照抗体 2、试剂盒组分： A. Provided Kit Components Store at 4℃: ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 ml ChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 ml Low Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml High Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml LiCl Immune Complex Wash Buffer 24 ml TE Buffer 24 ml 0.5 M EDTA 250 ul 5 M NaCl 500 ul SDS Lysis Buffer 10 ml 1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul 10X Glycine