流式技术在白血病诊断的应用.ppt

大多数淋 巴样组织可用轻柔的机械方法快速分离，并保持收获细胞的相对完整。某些组织由于细胞间连接紧密，需在机械分离的基础上用蛋白水解 酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓标本亦可能因骨细胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要确认酶的使用没有改变、减弱靶抗原的表 达，细胞活性没有显著降低。 样本的任何处理方式都可能导致靶细胞群体的丢失。所以应尽可能使用最接近原始标本状态的处理过程。去除红细胞是流式分析要求的至 少步骤。溶血剂的选择应基于其选择性去除成熟红细胞而最小程度的影 响其他细胞的特点。 溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响；，否则会影响细胞活性及表面标记结果 。白血病细胞的相对频率较难分析，某些重要细胞群体可能 选择性丢失。根据密度梯度原理，若白血病细胞没有与淋巴细胞相似的浮力密度即可能丢失。所以用此方法时应检查各层细胞特性以 有些抗原同时存在于胞膜和胞浆，这就使样本的细胞活性检测变得重要通过染色，活细胞将拒染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行 大多数可帮助白血病免疫分型的抗原都在细胞膜上所以在细胞表面抗原检测时应 特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。如TdT, MPO, cCD3, cCD22, 以及胞浆内Ig的表达固定剂和通透剂都可能对细胞和参数有不 同的多重影响，应根据情况选择。每一步染色对荧光素的选择和抗体的选择都很重要。 可以鉴别样本中的所有细胞亚群包括正常和异常群体。应该指出， 由于肿瘤细胞常常缺少细胞的正常标记或表达异常，所以特异性抗体一定程度上的重复选择有时是必要的。 对表达少的抗原表位应尽可能选择强度强的荧光素。 是门内的细胞代 表所有感兴趣的细胞，而且没有其他细胞的污染 通过细胞特异的抗原表达确定其光散射区域的backgate的方法也很实用 通常要比阳性百分率的计算更有价值。 但由于试剂和机器上的不同，仅仅基于荧光道数的简单标准 现行的 标准如20%阳性等都仍是人为的标准。依照直方图上与对照组相比向右移动来判断阳性所需的最小位移也是人为的标准。 ⑴选择抗体组合的基本原则如下 1）所选的抗体组合应足够宽，抗体的数量越多，检测的灵敏度越高。 2）抗体的选择应可以区分正常和异常细胞，正常细胞-内参照，异常细胞的表达比例-准确（如现在用CD45抗体来区 分正常和幼稚细胞，此方法尤其在幼稚细胞含量少时更显优势。） 3）荧光强度和表位密度应同时考虑。 4）必要时用活性检测排除死细胞较强的非特异性染色。（国外统计，约70%组织样本和48%血或骨髓标本有活性检测结果） 5）实验人员应了解所用抗体的反应细胞谱，以及与特定荧光素结合后的染色模式。相同的CD编号的不同抗体可能有不同的结合模式。 ⑵常用的方案考虑 1、大而全的抗体组合：全面了解抗原表达，无需额外染色，省时但 费用高。 2、先用筛查试剂了解样本的一般情况，再根据所得信息采用第二线特异性更高的抗体组。经济，但费时，（只有约30%国外实验室采用此法。） 3、选用有目标性的抗体组合以 确认可疑的诊断或分类。 4.　样本获取 1、一般每个标本应获取1-2x104个有核细胞的荧光和散射光信号， 2、微小残余病变分析则需5x104个细胞。 3、恶性细胞常有较宽的 大小及范围，获取时最好收集无门的数据以保留所有未知异常细胞群体的所有特性。 4、免疫荧光信号要求对数放大和至少256的分辨率。（无论选择对数或线性放大都要以保证异常细胞都能被检测到。 ） 5.　数据分析 1、多参数分析，（采用的参数越多，分析步骤越复杂，流式免疫分型的灵敏度越高。）  2、最少 的要求应是4个参数（2个光散射和2个荧光参数）。 分析技术：数据的分析方式随样本的特性、抗体组合及临床情况的不同而变化。 总的原则：用多参数的数据可以区分正常和异常细胞的图形，如FSC vs. SSC, FL vs. FL, 等，散射光与荧光参数的综合分析常常能提供有效的信息。 　分析步骤： 1、首先分析所有细胞的抗原表达情况，鉴别出正常细胞和异常细胞群体。 2、正常细胞的表现可以作为整个实验染色过程的内部 参照，提供实验一致性与否的客观证据。 3、异常细胞则通过进一步设门分析确定表型特点。 　设门 1、选择特殊的细胞群体分析各个参数，把分析局限在门内的细胞群体。 2、不同疾病的设门策略亦不同，常用的FSC vs. SSC的设门方式 在急性白血病中，CD45和SSC的双参数显示是鉴别幼稚细胞的一个简 单而有效的方法； 在B细胞淋巴瘤中用一个全B细胞的抗体设门来看抗κ链和抗λ链的表现； 在T细胞淋巴瘤时用一个全T细胞抗体设门使 肿瘤细胞的分型更加明确。 通过CD14 vs.CD45的双参数分析区分多个区域的淋巴、单核和粒细胞群体。  　分