《高效液相色谱》课件.pptVIP

主要内容 酸性和碱性样品 酸碱平衡与反相保留 缓冲液的选择 pKa与化合物结构的关系 离子样品反相分离的优化 选择性的控制 离子对色谱 保留机制 初始实验 控制保留值范围和选择性 离子交换色谱 离子交换色谱　 保留机制 方法建立 硅胶柱　 酸性样品和碱性样品 为方便讨论，我们定义“离子溶质”为在通常pH范围内含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。 在HPLC分离条件下，离子电荷随pH发生变化的化合物简单地称作酸或碱。 在反相色谱（RPC）中，　疏水化合物样品的保留值较大。当某种酸（HA）或碱（B）发生解离，其疏水性将会大大减弱。因此在RPC中的保留值k可能下降10~20倍。 缓冲液的选择 最好先调节缓冲剂的pH，再加入有机溶剂。 选择具体缓冲剂时，应切记的几种因素： 缓冲容量 UV吸收度 其它性质：溶解度、稳定性、与样品和/或色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等 缓冲容量 缓冲容量由pH、缓冲剂pKa及其浓度决定 与样品化合物的情况类似，缓冲剂发生解离的pH范围为pKa±1.5。只有在此pH范围内缓冲剂才能有效地控制pH值。 10~50mM浓度的缓冲剂对RPC分离一般足够 pKa与化合物结构的关系 若不知样品组分的pKa值，可以通过样品的分子结构估计出。 较好的流动相pH 样品中最常见的酸或碱取代基[-NH2、-N(CH3)2等]、碱性杂环和羧酸（-COOH）基团。 与pH有关的保留值变化最可能发生于pH3~6的范围内，不包括烷基胺化合物。 无论已知还是未知样品，开始RPC方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相（pH3） 哪种HPLC法对离子样品最合适 RPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点，通常是首先的分离模式。 若分离不够理想，还可考虑在流动相中加入离子对试剂。 在离子对试剂浓度由零变至最大值时，会有RPC－IPC保留值的连续变化。所以起初的RPC实验有助于后面IPC分离条件的优化选择。 对特殊分离目的，可以考虑从离子对或离子交换色谱开始。 优化离子样品的相分离 离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似，主要差异为需用： 经pH缓冲的流动相 硅羟基效应最小的反相柱 当首次开始HPLC方法建立时，并不知道合适的分离是否需要改变pH，所以初始实验的流动相pH＜3最好。 下一步通过调节流动相强度（%B），以使样品具有合适的保留值范围0.5k20。 离子样品不大可能被强保留，很可能获得较宽的k值范围。因此方法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。 梯度选用宽范围（如5%→100%B），必须注意避免高%B时析出缓冲盐 调整峰间距，即尽量扩大样品的分离度或降价保留值范围，以便进行等度分离。 最后改变柱条件以最好地兼顾分离度、运行时间和柱压 选择性的控制 改变pH是改变分离选择性的最有效方式 pH值变化常常可导致离子化合物k值发生10倍或更大的变化。 其它可有效改变峰间距的条件是%B、溶剂类型（甲醇、乙腈、THF）、温度、柱类型（C8、C18、苯基、氰基）与缓冲剂浓度。 离子对色谱 离子对和反相HPLC共享有多种特征 两种分离使用的色谱柱和流动相大致相似，主要区别是离子对色谱（IPC）的流动相中加入了离子对试剂。 逻辑上，IPC是需进一步改善的RPC分离的一种补充方法 保留的基础 初始实验 特殊问题 人工峰 尽可能相近地匹配样品溶剂和流动相的组成，增大进样浓度、减小进样体积 缓慢的色谱柱平衡 阴离子试剂（如磺酸盐）用50-80%的甲醇－水作清洗剂易于除去。季铵试剂需用50%的甲醇－缓冲剂进行清洗。在用新流动相检查保留值重现性之前，应至少用20倍体积的清洗溶剂进行清洗。 较差的峰形 硅羟基　　 温度 离子交换色谱 离子交换色谱（IEC）可用于包括生物来源的混合物（氨基酸、低聚核苷酸、肽、蛋白质、核酸）、无机盐和一些金属有机化合物 因为IEC与离子对HPLC保留机制的相似性，许多可用IEC的分离也用IPC也可解决。 用IEC原因： 检测限 制备分离 多步分离 保留的基础 pH影响 IEC一般用于酸性或碱性样品。 阴离子交换色谱分离酸时，pH增大导致样品解离增多，保留值增大，而降低pH在阳离子交换HPLC中有利于碱的保留。（与RPC保留相反） 改变pH通常是改变选择性的良好办法 盐或缓冲剂类型 阴离子交换色谱中，不同置换剂的相对强度顺序为： 有机溶剂 与RPC相同，流动相中加入有机溶剂会导致保留值下降 方法的建立 通常很少使用离子交换色谱同时分离样品阴离子和阳离子 对于酸性或阴离子化合物，用强阴离子交换柱。 对于碱性或阳离子化合物，用强阳离子交换柱 pH＞6用于阴离子交换，pH＜6用于阳离子交换 若已知样品的pKa值，阴离子交换时，要求pH＞pKa，而对于阳离子交换，则要求pHpKa 缓冲剂浓度应比较