shh通过pi3kaktbcl-2途径保护氧化应激下的皮层星形胶质细胞及机制的研究-shh protects cortical astrocytes under oxidative stress through pi 3 kaktbcl - 2 pathway and its mechanism.docx

前言Shh（sonichedgehog,Shh），是一种胚胎发育相关基因，与脑损伤和神经退行性疾病相关[1-5]。我们以往的研究表明，原代培养的神经元经H2O2处理后可使Shh上调，外源性的Shh可以抗氧化应激而保护神经元[6]。然而，单靠内源性Shh抗氧化应激而保护神经元是不足的。Hedgehog家族包括Shh，Indianhedgehog（Ihh），Deserthedgehog（Dhh）[7]。通过与其受体Patched结合，释放与Patched结合的跨膜蛋白Smo（Smoothened），激活激活锌指家族转录因子Gli（glioma-associatedoncogene）[8]。Gli转位到细胞核，从而调节靶基因的表达，控制细胞生长、增殖和分化[9-10]。星形胶质细胞是大脑中最丰富的神经胶质细胞，抗氧化应激保护神经元[11-12]。然而，神经胶质细胞保护神经元的确切机制尚不完全清楚。最近研究表明，Shh也与星形胶质细胞的增殖和/或功能有关[2,13-14]。相对于神经元，星形胶质细胞的Shh的基础水平是相当高的[15]。最近，越来越多的证据表明星形胶质细胞也易受到氧化应激的影响[16-19]。那么是否在皮质星形胶质细胞氧化应激下Shh表达也上调，Shh蛋白是否主要由星形胶质细胞分泌，是否与氧化应激下星形胶质细胞的神经保护作用有关。在这项研究中，我们共培养星形胶质细胞和神经元来验证，星形胶质细胞释放的内源性Shh是否能够保护神经元。我们还验证了氧化损伤中残存的星形胶质细胞抗细胞凋亡，是否与Shh信号通路的激活有关。中文摘要背景与目的Shh信号转导通路可能参与神经系统疾病（脑梗塞、帕金森病）损伤的修复，这些疾病共有的病理生理基础是氧化应激。我们先前的研究发现，Shh在氧化性损伤的皮质神经元中高表达，并可能介导保护作用。然而，Shh的内源性增高并不足以保护神经元的氧化性损伤。文献表明Shh参与星形胶质细胞的发育及功能，而星形胶质细胞对氧化应激中的神经元有一定的保护作用。因此，本实验对内源性Shh的来源及其保护作用的机制进行相关探讨。材料与方法在H2O2处理的第4代培养的星形胶质细胞，用qRT-PCR和Westernblotting检测Shh信号转导通路中Shh、Patched1、Gli-1的表达，ELISA检测Shh的分泌。分别用Shh特异性抗体5E1和H2O2处理共培养的星形胶质细胞和神经元，ELISA检测MAP-2的表达（神经元生存率的指标）。分别用Shh信号转导通路阻滞剂Cyclopamine、外源性Shh、LY294002（PI3-K/Akt信号途径抑制剂），SB203580（p38MAPK信号途径抑制剂），UO126（ERK信号途径抑制剂）和/或H2O2处理星形胶质细胞，应用MTT和台盼蓝染色法检测细胞活性，用Westernblotting检测AKT、ERK、p38水平及其磷酸化水平的表达变化，用流式细胞仪检测细胞凋亡状况，用qRT-PCR和Westernblotting观察药物处理后细胞中Bcl-2和Bax的表达变化。结果在原代培养的皮层星形胶质细胞中，100μMH2O2明显增高Shh、Patched1、Gli-1的蛋白和mRNA表达水平，与100μMH2O2处理的神经元比较，其分泌的Shh明显增高。在神经元和星形胶质细胞共培养体系中，抑制Shh信号的激活(5E1)可明显抑制星形胶质细胞对神经元氧化性损伤的保护作用。我们的研究进一步发现，H2O2(100～800μM)对星形胶质细胞呈浓度依赖性损伤，200μMH2O2可以使细胞生存率下降至36.15±4.37%，外源性Shh可以明显增高星形胶质细胞的生存率，降低H2O2损伤所致的细胞凋亡率增高，而Shh的保护作用可以部分被Shh信号通路阻滞剂cyclopamine所阻断。我们发现，外源性Shh可以明显增高星形胶质细胞中Akt磷酸化的水平，而对ERK和p38的表达水平无明显作用。LY294002（PI3-K/Akt信号途径抑制剂）可以部分阻断Shh所致的细胞生存率增高，降低Shh所致的细胞内Bcl-2水平的增高。结论本课题通过体外实验初步研究了Shh对星形胶质细胞氧化损伤的影响，我们发现氧化应激可以诱导星形胶质细胞分泌Shh，并参与星形胶质细胞对神经元的保护作用。外源性Shh通过调控PI-3k/Akt/Bcl-2信号途径参与对星形胶质细胞的氧化性损伤的保护作用。关键词Shh；氧化应激；星形胶质细胞AbstractObjectives:Inourpreviousstudy,wefoundthatthesonichedgehog(Shh)signalingpathwayisactivatedinneuronsunderoxidativestressandplaysane