shrna诱导brms1基因沉默调控卵巢癌细胞侵袭转移的实验分析-shrna induces br ms1 gene silencing to regulate invasion and metastasis of ovarian cancer cells.docx

广州医 广州医学院硕士学位论文 shRNA 诱导 BRMS1 基因沉默调控卵巢癌细胞侵袭转移的实验研究 PAGE PAGE 3 结果： 1. 成功筛选出高表达 BRMS1 的卵巢癌细胞株：OVCAR3。 2. 重组载体 BRMS1-shRNA 经酶切鉴定可以被 BamHⅠ切开，位点正确，而不 能被 PstⅠ切开，进一步测序结果与实验设计合成的 pGPU6/GFP/Neo-BRMS1 靶向目 标序列完全一致，成功构建了 pGPU6/GFP/Neo-BRMS1 重组质粒。 3. BRMS1-shRNA 转染卵巢癌 OVCAR3 细胞，经 G418 稳定筛选后，Q-PCR 和 Western blot 检测显示，干扰组细胞中 BRMS1-mRNA 和蛋白表达抑制率分别为 85.15%和 46.67%，差异有统计学意义（P0.01），成功构建了稳定沉默 BRMS1 基 因的卵巢癌细胞株。 4. BRMS1-shRNA 转染卵巢癌细胞后，体外粘附、侵袭、迁移和诱导血管形成能 力较对照组明显增强，差异有统计学意义（P0.05）。 5. BRMS1-shRNA 转染卵巢癌细胞后，Q-PCR 结果显示，CXCR4 mRNA 表达上 调，是空白对照组的 1.78 倍，差异有统计学意义（P0.05）。Western blot 结果显示， CXCR4 和 IL-6 蛋白在干扰组中表达上调，分别是对照组的 1.26 倍和 1.5 倍，而 ING4 蛋白表达下降，抑制率为 30%，差异有统计学意义（P0.05）。 6. EMSA 实验证实了 OVCAR3 细胞中 NF-κB 蛋白能与 CXCR4 基因启动子区的 DNA 结合，BRMS1-shRNA 转染卵巢癌细胞后 CXCR4 基因启动子的转录活性上调。 结论： 1. 成功构建 BRMS1-shRNA 真核表达载体，可稳定抑制人卵巢癌 OVCAR3 细胞 中 BRMS1 基因的表达。 2. 沉默 BRMS1 基因的表达可明显促进卵巢癌细胞的粘附、侵袭、迁移和诱导 血管形成能力。 3. BRMS1 沉默后，CXCR4 和 IL-6 的表达上调，而 ING4 表达下调，由此推测 上述肿瘤转移相关基因参与 BRMS1 调控卵巢癌侵袭转移的过程。 4. BRMS1 基因沉默通过上调包含 NF-?B 结合位点的 CXCR4 基因启动子的转录 活性，从而上调 CXCR4 的表达，最终促进卵巢癌细胞的转移。 关键词： 卵巢肿瘤；转移；BRMS1 基因；RNA 干扰；CXCR4 The regulation of shRNA targeting BRMS1 on the invasion and metastasis of human ovarian cancer cells Major: Gynecologic Oncology Postgraduated: Yingqun Zhou Supervisor: Prof. Xiujie Sheng Department of Obstetrics and Gynecology，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou, 510150, China Abstract Background Ovarian cancer is one of the most common malignant tumors in women, which is ranking the first among the leading gynecologic cancer. About 70% of patients have local or distant metastases before they seek medical attention due to lack of typical symptom and effective tests to make a diagnosis, as a result, five-year survival rate of patients with an advanced disease is still dissatisfied. Relapse and metastasis always result in poor clinical outcome. A better understanding of the metastatic mechanisms of ovarian cancer is therefore needed to determine effective therapeutic intervention