医学微生物学精品课件：实验6.pptVIP

* * 实验六 主要内容 （一）体外抗体形成细胞检测 （二） ELISA ——双抗体夹心法 （三）金免疫技术 ——斑点免疫层析试验 （四） E花环示教 体外抗体形成细胞检测（4人一组） 是将SRBC注射入小鼠腹腔，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞（B细胞）。然后将脾细胞、 SRBC、补体混合孵育。由于抗体形成细胞所分泌的抗SRBC的抗体和SRBC结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使SRBC溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑，所以本试验又称溶血空斑试验。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。 SRBC 来自免疫动物的脾细胞 [步骤与方法] 1．免疫小鼠及获取脾脏：用5%绵羊红细胞0.4ml注射于小鼠腹腔。——已完成 4天后拉脱颈椎处死，取出脾脏。 2.脾细胞悬液制备：将脾脏放入青霉素小瓶中，加入少量Hanks营养液，用小剪将细胞剪碎。 再加入数毫升Hanks液，用尖吸管吹打均匀，数层纱布过滤入小试管中，离心1000rpm10分钟。 洗三次，将沉淀的细胞悬于Hanks液中，细胞计数，配成107个/ml细胞浓度（将沉淀的脾细胞恢复4ml容积，即为约107／ml浓度的细胞悬液。）。 3.制作玻片小室：取载玻片 2 张，用窄幅双面胶带在其中 1 张载玻片三端和中间各粘一条，然后再覆盖上同样的载玻片，即形成 2 个玻片小室。 4.细胞混合液的配制： 取另一只小试管，加入107个/ml脾细胞悬液0.1 ml、20%SRBC 0.1 ml、1:10稀释的补体0.4 ml、小牛血清0.1 ml，混合均匀，小心不要出气泡。 5.细胞混合液的灌注：用尖吸管吸取上述细胞混合液，于玻片小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢）。 5. 蜡封（无需浸入过深，以能封闭小室边缘为准）、标记，将玻片平放于湿盒内，置37℃恒温箱45分钟。 结果 肉眼观察小室内的透明空斑，一个空斑即代表一个空斑形成细胞（PFC），即B细胞。 注意事项  （1） 小室注入液体时不要留有气泡。 （2） 小室边缘需用石蜡封严。 （3） 37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜。 酶免疫测定法（EIA） 用酶标记的抗体进行抗原抗体反应，通过酶作用于底物后产物显色来判断结果。 辣根过氧化物酶（HRP） 是酶免疫测定法中常用的一种酶；四甲基联苯胺（TMB）作为HRP的底物，比其它底物灵敏度且无致癌性。 在HRP的作用下，无色的底物TMB由H2O2氧化成蓝色产物，加等体积的2N硫酸溶液终止反应，pH值的降低使孔中反应液由蓝色变为黄色。 棕黄色 ，不溶性 二氨基联苯胺（DAB） 棕色，可溶性 5-氨基水杨酸（5-ASA） 黄色，可溶性 邻苯二胺（OPD） 蓝色（黄色 ），可溶性 四甲基联苯胺（TMB） 反应产物 底 物 ?HRP常用的底物及反应产物 分类： （1）酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 （2）酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）： 其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（ 聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测抗原，后者用于测定抗体。 实验材料 —— HBsAg诊断试剂盒 双抗体夹心法（4人一组） 酶联试剂 阳性对照 反应板 显色液 B 酶结合物 阴性对照 显色液 A 加样枪与吸头 浓缩洗涤液 终止液 【步骤与方法】 1. 已知抗体包被酶标板：将抗-HBs抗体稀释至工作浓度后，按每孔50μl加入酶标板，4℃过夜。 2.洗板：甩掉孔内液体，将洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干。重复3次后拍干（倒扣在吸水纸上）。 注意：1、2步已完成，本次实验从第3步开始！ 3. 将已包被的孔编号，分别加入阳性对照、阴性对照各1滴，每份标本加2孔 → 在各孔内加入酶标抗体1滴→ 37℃恒温箱温育30分钟。 阳性对照 阴性对照 阳性对照 阴性对照 4.洗板：甩掉孔内液体，将洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干。重复3次后拍干（倒扣在吸水纸上）。 5.各孔内加入底物液A（H2O2）、B（TMB—四甲基联苯胺）各1滴，轻轻摇动混匀，室温反应15分钟。 6.各孔内加入终止液1滴，观察结果。 阳性对照 阴性对