荧光定量RT-PCR检测AFP-mRNA基因表达.pptVIP

李 娜 朱勋梅 贾玮坤 荧光定量RT-PCR原理 RT-PCR技术与荧光探针结合 RT-PCR是将RNA经反转录酶的作用反转录（RT）合成cDNA，再以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 荧光探针随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加 荧光探针（TaqMan 探针 ） TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。 使用GenBank查找序列 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能 引物应具有特异性。 荧光定量PCR实验荧光强度的计算公式 Rn=总荧光强度 RB=基本（空白）荧光强度 XO=靶基因起始拷贝数 EX=扩增效率（0< EX < 1） n =扩增循环数 RS=每个荧光分子的荧光强度 荧光定量PCR是近两年发展起来的一项新技术。该技术既巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性，探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性及计量高准确性等优点，同时又克服了普通PCR技术易污染、不能定量、探针杂交灵敏度不高、分离洗脱条件不易控制等不足。 而且检测结果用拷贝数来表示起始模板的含量，相对半定量RT-PCR中的比较值更为准确可靠，有利于定量标准的统一，便于不同的实验室之间进行比较，因此在疾病的基因诊断中有广阔的应用前景。 为进一步明确肝癌组织与癌旁组织的AFP基因转录水平的改变，我们首次应用荧光定量PCR定量检测AFP mRNA的方法对33例肝癌组织、癌旁组织中AFP mRNA进行定量分析。结果表明肝癌组织中AFP mRNA的平均水平105分子数/μgRNA，而癌旁组织中AFP mRNA的平均水平仅为103分子数/μgRNA，肝癌组织中AFP mRNA的表达水平比其癌旁组织平均高出2个数量级。 这一结果与Matsumura M报道一致［6］。在本研究中12例血清AFP阴性（＜200μg/L）的原发性肝癌患者中，其肝癌组织AFP mRNA表达阳性，说明AFP mRNA比血清AFP更敏感，联合检测癌组织AFP mRNA可能有助于提高血清AFP阴性或低阳性肝癌的确诊率。 今后，将进一步应用荧光定量RT-PCR方法对肝癌患者外周血中AFP mRNA定量检测，探讨其表达水平与临床参数的关系及其在诊断肝癌微转移病灶的可行性。 O(∩_∩)O 谢谢~ 李 娜 朱勋梅 贾玮坤 荧光定量RT-PCR检测AFP mRNA基因表达 退火，开始延伸 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Forward Primer Reverse Primer TaqMan? Probe R Q 替换 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Forward Primer Reverse Primer R Q 剪切 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Q R 延伸结束 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ R Q 甲胎蛋白（AFP） 甲胎蛋白是胎儿肝细胞产生的一种特殊蛋白－－糖蛋白，它是胎儿血清的正常成分，临床上发现肝癌细胞能合成甲胎蛋白，因此，在原发性肝癌病人血清中， 甲胎蛋白明显升高。 AFP是原发性肝细胞肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志、 AFP阳性患者进行AFP动态或定期检查，有助于了解病情的发展。 实验方案 一、实验目的 建立荧光定量RT-PCR方法检测AFP mRNA基因表达的方法 了解肝癌组织中AFP mRNA的表达水平。 二、实验 材料与方法步骤 1.1? 病例选择及取材? 收集住院确诊的原发性肝癌病人。术中切取 少量新鲜的肝癌 组织及癌旁1cm 的肝组织。 1.2? 引物、探针的设计合成? 1.3? 组织总