构树叶总黄酮对肝癌hepg-2细胞增殖和凋亡作用的分析-effect of total flavonoids from broussonetia papyrifera leaves on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma hepg - 2 cells.docx

构树叶总黄酮对肝癌 HepG-2 细胞增殖和凋亡作用的研究中文摘要研究内容和目的1 采用微波辅助提取法从构树紧中提取构树叶总黄酮，经大孔树脂 柱、聚酰胺柱进行分离纯化，做初步鉴定。2 体外观察构树叶总黄酮抑制肝癌细胞株 HepG-2 细胞生长的作用， 明确量效关系，选择药物的半数抑制浓度为后期进行构树叶总黄酮抗肝 癌机制研究做参考。3 为开发利用构树叶资源提供科学的实验依据。研究方法1 采用微波辅助提取法，提取构树叶总黄酮初品，将提取物进一步 进行分离鉴定。2 应用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）法测定不同 浓度的构树叶总黄酮作用不同时间（24h、48h、72h）对人肝癌 HepG-2 细胞的生长抑制率。3 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 不 同 浓 度 的 构 树 叶 总 黄 酮 作 用 人 肝 癌HepG-2 细胞后的形态学变化。4 采用 hoechest33342 荧光染色观察不同浓度构树叶总黄酮作用于 人肝癌 HepG-2 细胞 48h 后细胞凋亡形态变化。5 通过免疫组织化学方法检测人肝癌 HepG-2 细胞经构树叶总黄酮诱导凋亡过程中的 Bcl-2、Bax 蛋白表达。6 RT-PCR 检测 Bcl-2、Bax 相关基因经构树叶总黄酮处理前后表达 变化。研究结果1 微波辅助提取法提取构树叶总黄酮，经过分离纯化后，测定提取 得率为（139mg/100g）。2 MTT 结果显示，构树叶总黄酮对人肝癌 HepG-2 细胞的生长抑制作用 呈现时间依赖性和剂量依赖性。实验组在 24 小时后，3、6mg/ml 构树 叶总黄酮对人肝癌 HepG-2 细胞的抑制作用不明显（P0.05）9、12mg/ml 的抑制作用与对照组相比较,差异具有统计学意义，（P0.05）。48 小时、 72 小时后 3、6、9、12mg/ml 浓度的构树叶总黄酮对人肝癌 HepG-2 细 胞均具有抑制作用，随着浓度的增加，呈时效和量效关系。48h 的各浓 度抑制率分别为 20.2%，29.44%，39.21%，43.96% ，将 3mg/ml，6mg/ml,9 mg/ml,12 mg/ml 选为实验所用浓度，9mg/ml 仅作用 48h 仅用于细胞的 形态学观察3 在倒置显微镜下可以看到，对照组人肝癌 HepG-2 细胞呈梭形， 形态饱满，成片排列，胞质丰富分布均匀，细胞核大；细胞经过 6mg/ml 构树叶总黄酮处理 48h 后，可观察到，细胞排列紊乱，轮廓不规则，细 胞膜皱缩、变园、脱落，细胞内胞质分布不均匀，细胞体积变小，细胞 数量变少。hoechest33342 荧光染色观察对照组肝癌 HepG-2 细胞细胞膜 完整，细胞核形态饱满，核质染色均一，着色较浅；HepG-2 细胞经过12mg/ml 构树叶总黄酮处理 48h 后观察可见，细胞膜发生皱缩，细胞核相对变小，荧光增强明显，细胞核染色质发生浓集并碎裂呈圆形的细胞 碎片，此即为凋亡小体，表现典型的凋亡形态特征。4 免疫组化结果显示，经构树叶总黄酮诱导的人肝癌 HepG-2 细胞， 促凋亡蛋白 Bax 表达上调，变现为阳性细胞数增加和染色加深，当药物 浓度达 9mg/ml 阳性率达 36.17±0.05，与对照组比较，差异具有统 计学意义(P0.05)。而凋亡抑制基因 Bcl-2 表达降低，表现为阳性细胞 数减少和胞浆着色变浅，细胞核内几乎不见着色。当药物浓度达 9mg/ml 阳性率达 30.45±1.52，与对照组比较，差异具有统计学意义(P0.05)。5 RT-PCR 结果表明，3、6、9、12mg/ml 构树叶总黄酮诱导 48h 后 的人肝癌 HepG-2 细胞，Bax 的 mRNA 水平随着药物浓度的增加而升高， 而 Bcl-2 的 mRNA 水平随着药物浓度的增加而降低。(P0.05)研究结论1 微波辅助提取法是一种高效、节能的提取方法。2 构树叶总黄酮对人肝癌 HepG-2 细胞有明显的生长抑制作用，且 抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性。3 构树叶总黄酮能够诱导人肝癌 HepG-2 细胞，可能与上调促凋亡 因子 Bax，以及下调抑制凋亡蛋白 Bcl-2 表达有关。关键词 构树叶总黄酮；HepG-2 细胞；凋亡； Bcl-2、BaxThe Research on the Effects of Total Flzvonoids of Broussonetia Papyrifera on Proliferation and Apoptosis of HepatocellularCarcinoma Cell HepG-2Objective:Total flavonoids was extracted from broussonetia pap