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亚低温治疗新生大鼠HIE神经保护作用研究 （郑州市儿童医院新生儿科，河南　郑州，450000） 　　【摘要】　目的：动态观察亚低温治疗新生HIE大鼠脑神经元凋亡及神经元内BDNF表达情况，并通过水迷宫实验评价大鼠记忆功能，探讨亚低温对HIE大鼠治疗的神经保护作用。方法：建立新生大鼠HIE模型，并于6小时内进行亚低温(31℃)治疗和对照(37℃)48小时，干预后24小时、一周及28天通过免疫组化进行脑海马BDNF及神经元调亡检测对比。结果：24小时、一周治疗组和对照组比较海马BDNF表达有明显差异(p0.05)。结论：新生大鼠HIE早期压低温治疗对神经元有明显保护作用，保护作用并能维持直一周后,保护作用表现为BDNF的表达增高及神经元凋亡的降低。 　　【关键词】　亚低温； BDNF； 经元调亡 　　新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿期常见的神经系统损害，积极寻找合理、安全、有效的治疗措施仍是当前儿科医学的研究重点之一。本研究基于亚低温近期亚低温对HIE的神经保护作用，进行亚低温治疗后一周的脑海马BDNF及神经元调亡的检测，旨在证明亚低温治疗的神经保护作用，为临床亚低温治疗提供更充分依据。1 　材料和方法1.1　材料 选取新生7日龄SD大鼠,性别不限，体重13～16克90只(重庆医科大学实验动物中心提供)。BDNF和神经元调亡检测试剂盒由中衫公司提供。半导体温度测定仪由上海医用仪器表厂生产。Morris水迷宫由重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所提供。1.2　方法 1.2.1 　新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型的制备按Rice法[1]制作。大鼠乙醚吸人麻醉后取仰卧位，四肢固定，取颈正中切口，结扎左侧颈总动脉，缝合切口后放回原饲养环境中恢复2～4 h，入2000ml密闭容器置于37℃水浴中，维持容器内温度36±1℃，以2～3 L／min的速度输入8％ 的氧气和92％的混合气体持2～4 h。1.2.2　实验动物分组 90只大鼠随机分组：①假手术组(n=30)：仅游离左颈总动脉，不做结扎；②亚低温干预组(n=30)：大鼠HIBD模型后置于500 ml通气容器中，将容器置于31℃恒温水浴环境中，将温度探头置人大鼠直肠内5mm处，连接半导体温度测定仪，连续监测直肠温度，使其维持在31℃ 48h，期间每2小时喂奶一次。③对照组(n=30)：大鼠HIBD模型后放人500 ml通气容器中，将容器置于37℃恒温水浴环境中48小时，喂养方法同上组。1.2.3 　标本制备与检测 1.2.3.1　各组于干预后24小时、1周及28天分别选取10只，断头取脑，4％多聚甲醛固定，各组选取海马部位(切片头段始于胼胝体交叉的起始水平，尾端到前联合交叉前沿)，石蜡包埋，制作石蜡切片。1.2.3.2　光镜检查 免疫组化进行脑海马BDNF检测(按试剂说明书操作)，海马Tunel染色进行神经元调亡检测(按试剂盒说明书操作)。取海马部位以4×100倍光镜下计数8个视野中的BDNF表达光密度值（IOD值）和Tunel阳性细胞数，将视野中IOD值和阳性细胞数总和作为统计参数。1.3 　统计学处理 所有数据以均数加标准差(x±s)表示，运用SPSS10.0软件包进行分析设计的方差分析，p 0.1)；一周，BDNF的表达仍比对照组增高统计学有明显差异(p 0.1)；饲养28天龄后，亚低温组海马的BDNF表达与对照组及假手术组相比较均无明显差异(p 0.1)。见表1。 　　 表1 三组大鼠不同时间点BDNF表达的变化(ｘ±s)注：a 表示与对照组比较有明显差异p 0.1，c 表示与假手术组比较无明显差异p 0.12.1.2　 TUNEL染色　干预后24小时，亚低温干预使海马神经元调亡减少，亚低温组和对照组比较神经元调亡明显少于对照组(p 0.1)。见表2。 　　表2 三组大鼠不同时间点海马神经元的TUNEL阳性细胞数(x±s) 　　注：与对照组相比a表示p 0.13　讨论 　　缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是围生期窒息的严重并发症，病死率和致残率较高。亚低温治疗是采用人工诱导方法将体温下降2～6℃，目前已成为HIBD最有前途的治疗措施之一[3]。众多对亚低温神经保护机制的研究表明，亚低温可降低脑细胞能量代谢需求，降低兴奋性氨基酸的释放，抑制氧自由基爆发和脂质过氧化，以及在抑制神经元凋亡方面发挥重要作用。 　　脑原性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的一个成员， BDNF与成年大鼠缺血再灌注关系的研究表明，缺血再灌注大鼠海马、皮层BDNF mRNA的表达较正常组织增加，有利于损伤细胞的存活、恢复，对神经元起到保护作用[45]。本试验中，HIBD后48小时，海马BDNF表达明显增高，并能持续