《分子生物学常用技术在中医药研究中的应用》实验课 09 RTPCR.pptVIP

* * 实验 20 RT-PCR 目 的 观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）以其灵敏度高，要求样品量少，实验周期短而倍受青睐。有人将RT-PCR实验结果与Northern blot结果等进行比较分析，发现两种不同方法所得到的实验结果相一致。 类似的有Northern blot、原位杂交，甚至原位PCR等。 原 理 首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶的活性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠Taq DNA聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的DNA产物。最后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并进行图象分析。 实验准备 实验步骤 1．分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各样品总RNA取5ul加入1ml水中测OD值，当OD260/OD280≥1.8时，方可使用。根据以下公式计算RNA的浓度： 样品总RNA含量（ug/ul）=OD260×稀释倍数×40/1000 2．反转录 水 7ul dNTP（each 10mM） 2ul 5×buffer 4ul DTT（100mM）