《分子生物学常用技术在中医药研究中的应用》实验课 04 阳性单菌落扩增与小量DNA制备.pptVIP

* * 实验 3 阳性单菌落扩增与 小量DNA制备 目 的 1．为进一步鉴定重组质粒，提供适量的质粒DNA——排除自身环化。鉴定方法主要有： （1）PCR法。采用载体两端的引物进行PCR，一旦插入成功，则可以在电泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。 （2）Southern blot法。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固定，以插入片段为探针作Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。 （3）酶切鉴定法。 2．提供一定数量的DNA以满足一些实验 比如： （1）测序； （2）准备杂交用的探针。 这是该实验的两个主要目的。 原 理 挑选单一菌落，培养扩增。 离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性溶液处理形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA等得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒DNA将溶于上清之中。 上清经乙醇沉淀后，得到质粒DNA。 实验准备 （参考教材） 实验步骤 1．第一天（通常为下午） 从琼脂平板上挑取单一