人胚胎干细胞向心肌细胞的分化技术.pptVIP

人类细胞的体外培养，为深入研究细胞生物学、疾病过程、和可能的治疗方法提供了重要手段。人类胚胎干细胞的体外培养开创了多种新的可能性，其中包括了将它应用于人类的再生医(regenerative medicine)。 已有研究显示，hESC在体外培养的过程中具有分化成心肌细胞的潜力。可分化为具有节律性收缩的细胞团，并具有心肌细胞的电生理和免疫组织化学特性。 （在小鼠身上取的实 验效果） 该研究对于探索人类心肌细胞的生理学和药理学特性具有一定的意义，并可能在将来作为移植细胞来修复心肌,替代因缺血损伤等原因所失去的心肌细胞。 方法及步骤： 一、人胚胎干细胞系的衍生与培养 目前，人胚胎干细胞仍用传统方法建立，及培养在小鼠胚胎饲养层（MEF，mouse embryonic feeder）上并使用高浓度的非人类血清，大部分可供使用的人胚胎干细胞系需要与MEFs共培养，以维持胚胎干细胞的多潜能性和细胞增殖能力并且抑制胚胎干细胞的分化。 注意：1 大多小鼠的胚胎干细胞能在不含细胞饲养层的明胶包被的培养皿上生长只需提供足够浓度的白细胞抑制因子（LIF）即可。 2 与小鼠胚胎干细胞相似，人胚胎干细胞集落为密度依赖性，集落大时会自发分化。 操作方案 1 使胚胎生长到胚胎泡阶段，通常大约五天； 2 若胚胎未从透明圈里孵出，用5-10μl 的0.5%链酶蛋白 酶在37℃孵育直到透明圈溶解； 3 将无透明圈的胚泡与抗人抗体孵育10min； 4 用5-10μl20%的豚鼠补体与胚泡在37 ℃孵育5-15min，目的是溶解胚胎滋养层，此时用大孔吸管轻轻吹吸胚胎 将有助于溶解过程； 5 当全部溶解时，用吸管轻轻的取出完整的的内层细胞团并立即转移到含有500μl hES培养基的MEFs培养板上； hES培养基：白细胞抑制因子（LIF）1000 U/mol, DMEM（高葡萄糖，无左旋谷氨酰胺） 240ml， 2-巯基乙醇 14.3mol/L 等， 用250ml的PES膜过滤系统过滤。 6 内细胞团(ICM)细胞2-5天内将贴臂,每天观察细胞的生 长，要在原位停留15天以上,可添加新灭活的MEFs（只有 当集落达到足以传代时才将它转到新的MEFs培养板上）； 7 从ICM来源的细胞具有类干细胞形态，通常出现在集落 的中心； 8 当克隆达到约0.1-0.5mm大小时，用拉长的玻璃吸管将 它切割成2-10小块并转移到2-4孔新的失活的MEFs培养 板中，每5-7天重复一次； 9 在新建立的hES细胞系前几次传代之后，hES细胞即可 继续增值； 二、胚胎干细胞向心肌细胞的分化 为了诱导心肌细胞的分化用胶原酶Ⅳ把hESC消化分散为小的细胞团（3-20个细胞）随后让细胞团在悬浮状态下生 长7-10天形成胚胎样小体结构（EB）。 将EB移植到明胶包被的培养皿中培养，自然生长4天后，可第一次观察到搏动区域 ，在植入培养皿后20天，搏动区域数目达到最多,约有8.1%是跳动的。 在分化过程中，血清对于分化效率是一种重要的影响因子，迄今的大部分培养基含有血清，且分化效率依赖于血 清的批次，推测血清中可能含有抑制因子。最近试验发现，在用无血清的培养基进行hES2-END2共培养的情况下，心肌细胞的产生率提高了20倍以上。 （ END2：小鼠脏臂内胚层样细胞系） 操作方案 1 接种hESC细胞团前至少1.5h，用不含FBS（胎牛血清） 的hESC培养基为经过丝裂霉素c处理的END2细胞换液。 2 准备用来清洗未分化hESC集落的平皿。 3 将0.5mol中性蛋白酶加入培养皿，至于培养箱7min，从MEFs集落中分离hESC。 4 用带有蓝吸头的1ml移液器从12个器官培养皿内手机所有未分化的hESC集落，将其置于3个预先装有D-PBS（含有Ca2+和Mg2+的完全磷缓冲液）的培养皿内洗涤。 5 把集落移到3个新的含有D-PBS的平皿内，除去集落上的MEFs细胞。 6 再转移至2个含有1mol标准hESC培养基的器官培养基内。 7 用1mol移液器对着平皿底部上下吸吹，将集落分割成小块。 8 将hESC小细胞团转移到2个12孔盘内，其内