分子生物学复习(精编).ppt

1、RB 基因 和 p53 基因 RB 基因 第一个被发现的抑癌基因 视网膜母细胞瘤，抑癌基因RB （-） RB基因位于第13号染色体长臂13q14 表达产物RB蛋白 DNA结合蛋白 （-）细胞周期G1期 p53 基因 第二个被发现的抑癌基因 大多数癌症的发生与p53 基因缺失有关 p53 基因位于染色体17p13 表达产物p53蛋白 转录因子 （-）细胞周期G1期进入S期 激活DNA损伤修复蛋白，保持基因组的稳定性 诱导细胞凋亡 * 2、DNA和RNA肿瘤病毒的致癌机制 DNA肿瘤病毒 致癌机制 (抑制抑癌基因） DNA肿瘤病毒癌基因表达产物+RB蛋白 细胞周期调节 RNA肿瘤病毒 致癌机制 （加强癌基因） 改变细胞信号传导途径 RTK-Ras-MAPK 十一、基因工程的基本原理（一)基本概念 基因工程 对基因进行设计、改造的分子工程，包括： 基因重组（核心：重组DNA技术） 克隆 表达 克隆 无性繁殖产生一系列相同的复制品 分子克隆 基因重组 在宿主细胞扩增 获得相同的DNA分子 （二）基因工程的基本过程 目的基因的获得 化学合成 基因组DNA文库（原核、真核） cDNA文库 PCR（RT-PCR） 载体的选择/改造 克隆载体 质粒、噬菌体、病毒DNA 表达载体 插入的外源DNA可转录、翻译成多肽 目的基因与载体连接 限制性内切酶/DNA连接酶 重组DNA分子导入细胞 转化（细菌）/转染（细胞） /转导（噬菌体） 筛选、鉴定重组体克隆 筛选：抗药性标志/LacZ/X-gal 鉴定：RE/PCR/ DNA测序/ Southern 印迹技术 目的基因的表达和 产物（蛋白质）的 纯化与鉴定 原核基因表达体系：E.coli(包涵体） 真核基因表达体系：酵母/哺乳动物细胞 昆虫细胞 纯化方法 1.凝胶过滤层析技术 2.离子交换层析技术 3.亲和层析技术 4.HPLC 分析鉴定 分子量测定———SDS定性定量测定——ELISA 纯度鉴定————Western Blot、 HPLC 等电点测定———等电聚焦电泳 结构分析————氨基酸组成分析 氨基酸序列分析 肽谱图 生物学活性———细胞学实验/动物实验 基因文库 基因组文库 以DNA片段的形式储存某一生物细胞 全部基因组DNA序列的克隆群体 cDNA文库 以cDNA片段的形式储存某一生物细胞 在一定条件下表达的全部mRNA反转录 而成的cDNA序列的克隆群体 PCR技术的原理与应用 原理 模拟体内DNA复制过程，体外扩增某一特定DNA片段 PCR反应体系 模板： 拟扩增的DNA分子 引物1： 与5’末端互补的寡核苷酸片段 引物2： 与3’末端互补的寡核苷酸片段 原料： dNTP 酶： 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 反应环境：Mg2+/反应缓冲液 反应基本步骤 变性：95℃，模板链成为单链 退火：Tm-5 ℃，引物与模板链结合 延伸：72 ℃， DNA聚合酶以dNTP为原料 按半保留复制机制沿模板链延伸完成新DNA合成 多次循环（25-30次），扩增目的DNA片段 PCR技术的主要用途 重要的PCR衍生技术 目的基因的克隆 （RT-PCR） 反转录PCR技术 （RT-PCR/定性） 基因的体外突变 原位PCR技术 （定性） DNA和RNA的微量分析 实时PCR技术 （定量RT-PCR） 基因突变分析 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 载体 质粒 存在细菌染色体外环状DNA 独立自主复制 含有抗药基因 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 含有多个RE位点供外源基因插入 克隆载体 质粒 表达载体 （原核） 克隆载体 复制起始点 多接头克隆位点（外源基因和载体正确连接） 选择标记 强启动子 核糖体结合点（SD序列） 翻译起始点 转录翻译终止信号 重组DNA技术中常用的的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDN