猪链球菌2型glna和glnr对tca循环酶调控的研究-预防兽医学专业论文-预防兽医学专业论文.docxVIP

猪链球菌2型GInA和GinR对TCA循环酶调控的研究 猪链球菌2型GInA和GinR对TCA循环酶调控的研究 摘 要 猪链球菌2型(Streptococcus suis Serotype 2，＆suis 2)编码谷氨酰胺合成酶及 其转录调控因子的基因分别是glnA和glnR。通过构建glnA和gtnR的基因缺失株 AGlnA和AGlnR，分别感染CDl小鼠发现突变株AGlnR和AGlnA毒力都有所下降， 且AGlnA毒力下降非常显著，在各组织器官活菌数与野生株相比显著降低。这些结 果说明谷氨酰胺合成酶在猪链球菌2型感染过程中，尤其在粘附和定植过程中发挥 着重要的作用。通过生物信息学分析，在乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶 操纵子启动子区发现了GlnR结合的保守序列，而异柠檬酸脱氢酶的产物a一酮戊二 酸又可以在谷氨酸脱氢酶的作用下生成谷氨酸，和谷氨酰胺代谢相关。因此，我们 推测谷氨酰胺代谢和三羧酸循环(TCA循环)中有着一定的联系。本研究以猪链球 菌2型SCl9为亲本菌株，开展了如下工作： 1．GlnR和GInA原核表达、纯化及GInA的体外定点突变 参考NCBI的Genbank中猪链球2型05ZYH33基因组序列，以SCl9的基因组 DNA为模板，PCR分别扩增glnA和glnR基因，将扩增的基因连接到原核表达载体 pET28a，构建了表达质粒pET28a-glnR、pET28a．glnA。预测了GlnA的可能关键氨 基酸位点且通过重叠延伸PCR介导的定点突变将GlnA的54、67、133和308位氨 基酸进行了定点突变，同样构建原核表达载体后转化到大肠杆菌表达菌株BL21中， 经诱导表达，得到了目的蛋白。将目的蛋白纯化并检测GlnA及氨基酸位点突变的 GInA酶活，发现67和133位的氨基酸突变后酶活丢失，是GlnA关键酶活位点。 2．GinR和GlnA对TCA循环酶调控的研究 利用实时荧光定量PCR检测了AGlnR、AGlnA突变株和WT野生菌株TCA循 环中乌头酸酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶基因的表达情况。结果显示：乌头酸 酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶在AGlnR、AGlnA表达都比WT低。而PCR扩增 该操纵子的启动子，并将与GlnR结合的DNA进行了定点突变，通过电泳迁移率实 验发现GlnR能够与该启动子的保守区域结合，且结合不依赖GInA的互作。 3．猪链球菌2型乌头酸酶基因突变株AAcnA的构建 PCR分别扩增了乌头酸酶基因的上游片段、下游片段和红霉素抗性基因，按上 游片段、红霉素抗性基因、下游片段的顺序共同连接到温敏型自杀性质粒pSET4s 上，得到重组质粒pSET4s-AcnA。将重组质粒pSET4s．AcnA电转化到SCl9感受态 细胞中，通过抗性和温度筛选到对壮观霉素敏感而对红霉素不敏感的菌落，再用 PCR、RT．PCR和测序确认突变株AAcnA构建成功。 4．突变株AAcnA的生物学特性研究 对AAcnA突变株和WT进行一系列生物学特性分析(遗传稳定性、生长曲线、 形态结构、溶血活性、细胞感染实验和小鼠半数致死量)。结果显示AAcnA在对数 生长期后期生长速度有所减慢，对Hep．2细胞的粘附和侵入能力有所上升，其它特 一_————————————————————————————————————————————一 一_————————————————————————————————————————————一．兰±奎些奎兰!!!!壁塑主婴茎竺兰垡垒奎 一—— 性与野生菌株相比没有显著差异，表明乌头酸酶对猪链球菌2型的毒力没有影响。 这些结果说明GlnA和Gl出对猪链球菌2型毒力的影响并不是通过调控TCA循环 来发挥作用。 关键词：猪链球菌2型；GlnA和GlnR；TCA循环；乌头酸酶 2 猪链球菌2型GInA和GlnR对代A循环酶调控的研究Abstract’。 猪链球菌2型GInA和GlnR对代A循环酶调控的研究 Abstract’。 Glutamine synthetase gene and its regulatory factors ofStreptococcus suis serotype 2 @suis 2)ale gird and glnR．GlnR and gird gene deletion mutant AGlnA and AGlnR were constructed to infect CD I mice．The date showed that AGird and AGZ艘were attenuated and AGInA was significant decreased in virulence．The numbers of viable AGlnA in variou