猪rock1和rock2基因转录调控机制研究-动物遗传育种与繁殖专业论文.docx

本研究由国家转基因动物新品种培育重大专项 本研究由 国家转基因动物新品种培育重大专项 (2008ZX08006．002)，“973刀计划项目(2014CBl38504) 和国家农业产业体系(CARS．36)共同资助 This proj ect was finally supported by the Grants from the National Project for Breeding of Transgenic Pig(2008ZX08006-002)，National Key Basic Research Program of China(20 14CB 138504)and Chinese Agriculture Research System(CARS-3 6) 万方数据 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 圣 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特另4加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：．弘 时闻：≯Ⅳ年莎月Jf∥日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存．汇编学位 论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：保密学位论文(印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用于本授权书．撇文作槲：触导 ∥1| 签名日期：7口“年f；月如日 签名日期：2D彤年多月，／B 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 万方数据 猪RDCx，和RD 猪RDCx，和RD C：l舶基因转录调控机制研究 目 录 摘{要 ．i ABSTRACT ．．iii 常用缩略词表 v 第一章文献综述 ．．1 l前言 ．．1 2肌肉的生长发育过程 ．．1 3与肌肉形成相关的信号通路 ．．3 4候选基因的选择 一5 4．1 ROCKl，RDC艘基因 5 4．2 Spl转录因子 一7 5基因转录调控的研究 ～8 5．1启动子 9 5．1．1启动子的结构和分类 9 5．1．2启动子与肌肉发育调节 10 5．1．3启动子的研究方法 11 5．2 miRNA． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ．12 5．2．1 miRNA的形成、发育、功能 12 5．2．2 miRNA与肌肉发育调节 14 5．3．3 miRNA的研究方法 ．16 第二章研究的目的和意义 18 第三章材料与方法 19 1实验材料 19 1．1试验样品 ．．19 1．2主要仪器与设备 ．．19 1．3主要试剂及试剂盒 一19 1．4常用化学试剂配制 一20 1．5载体、菌株及细胞系 ．．22 1．6主要分子生物学软件及数据库 ．23 2试验方法 ．．23 万方数据 华中农业大学2016届博士研究生学位(毕业)论文2．1总RNA的提取及eDNA合成 华中农业大学2016届博士研究生学位(毕业)论文 2．1总RNA的提取及eDNA合成 23 2．1．1总RNA的提取 ．．23 2．1．2 eDNA合成及合成效果检测 ．．24 2．2实时荧光定量PCR ．．25 2．3猪ROCKl和ROCK2基因5’上游调控区域的扩增 27 2．3．1序列扩增 27 2．3．2启动子5’端不同缺失片段载体的构建 ．28 2．3．2．2启动子5’端不同缺失片段真核表达载体的构建 ．．29 2．3．3质粒提取 ．29 2．4细胞培养和转染 29 2．4．1细胞培养 ．29 2．4．2瞬时转染 ．30 2．4_3细胞冻存与复苏 ．．30 2．5启动子活性检测 30 2．6蛋白质提取 3 l 2．6．1核蛋白质提取 ．31 2．6．2活性蛋白质提取 ．32 2．6．3总蛋白质提取 ．32 2．7猪ROCKl和ROCK2基因5’端上游调控区域转录因子分析 32 2．7．1转录因子的预测及分析 ．32 2．7．2转录因子结合位点突变载体构建 ．33 2．7．3凝胶迁移阻滞实验(EMsA) 34 2．7．4染色质免疫共沉淀实验(ChIP) ．